Enzymy

Enzymy jsou bílkoviny s biokatalytickou funkcí. Jsou nástrojem exprese genů. Výsledkem jejich působení v organismu je látková přeměna (intermediární metabolismus), která je projevem rovnováhy dějů anabolických a katabolických.

V katabolických dějích získává organismus energii pro mechanickou či osmotickou práci, ale také pro děje anabolické, jako je např. syntéza dalších prekurzorů, makromolekulárních látek, mediátorů a hormonů, nezbytných pro životní funkce a jejich regulace. Spřaženými enzymovými reakcemi jsou překonávány nevýhodné metabolické kroky (spojení reakcí endergonických s exergonickými).

• Látky, které se působením enzymů mění, se nazývají substráty.
• Hlavními rysy biokatalýzy jsou zejména značná katalytická účinnost a větší či menší specifičnost vůči typu substrátu i vzhledem k typu katalyzované reakce.
• Z bílkovinné povahy enzymu a jeho specifické interakce se substrátem za tvorby enzym-substrátového komplexu plynou i další vlastnosti enzymových systémů, jako je ovlivnění faktory fyzikální a chemické povahy. Vliv zde mají:
  • teplota
  • pH
  • ionty jako aktivátory apod.
  • inhibitory (kompetitivní nebo nekompetitivní)
  • efektory allosterické povahy

Obsah 1 Využití afinitní chromatografie: 2 Fyzikálně-chemické vlivy působící na činnost enzymů 2.1 Vliv teploty 2.2 Závislost enzymové aktivity na pH 2.3 Vliv iontů na enzymy 3 Stanovení enzymové aktivity 4 Oxidoredukční enzymy (oxidoreduktasy EC 1) 5 Warburgův optický test 5.1 Spřažené reakce

Využití afinitní chromatografie:

Specifické interakce enzymu se substrátem, substrátovým analogem či inhibitorem lze využít i při izolaci enzymu. Enzym jako bílkovinu lze ovšem izolovat postupy běžnými v biochemii bílkovin. V poslední době se s výhodou využívá afinitní chromatografie.

• Tato metoda využívá specifičnosti biologických interakcí typu: enzym-substrát, enzym-substrátové analogy nebo enzym-inhibitor.
• Existují i jiné možnosti specifických interakcí, např. typu antigen-protilátka, hormon-nosič (receptor) apod.

Afinitní chromatografie je zvláštním případem adsorpční chromatografie, při níž má adsorbent specifickou afinitu k látkám, které mají být izolovány.

• Při izolaci enzymu se naváže inhibitor nebo substrátový analog na vhodný nosič (např. Sepharosa&reg., což je agarosový gel připravený ve formě kulovitých částic). Taková navázaná skupina se specifickou afinitou se nazývá ligand (afinant).
• Často je nutné oddálit afinant od vlastního nosiče prostřednictvím tzv. raménka (spacer), aby nedocházelo ke sterickým zábranám při přístupu velké molekuly enzymu (bílkoviny) k malé molekule navázaného ligandu.
• Vazba enzymu na ligand je vratné povahy a tuto vratnou vazbu lze rozrušit změnou fyzikálně-chemických vlastností promývací tekutiny, např. změnou pH, iontové síly, nebo také nadbytkem volného substrátu či substrátového analogu, který vytěsní ligand z vazby na enzym.

Fyzikálně-chemické vlivy působící na činnost enzymů

[editovat část]

Vliv teploty

Většina chemických reakcí závisí na teplotě a reakce katalyzované enzymy v tom nejsou výjimkou.

• Podle kinetické teorie vykládáme vzrůst rychlosti reakce s teplotou až do dosažení optimální teploty zvýšenou kinetickou energií reagujících molekul, což přispívá také ke tvorbě enzym-substrátového komplexu.
• Teplotní koeficient Q₁₀ je poměr, kolikrát se rychlost chemické reakce změní se vzrůstem teploty o 10 °C. U většiny chemických reakcí činí tento poměr asi 2, ale pro některé fyziologické pochody, katalyzované enzymy, je vyšší.
• Pro většinu enzymů je optimální teplota zhruba shodná s teplotou, která existuje v prostředí buňky, a pro teplokrevné (homoiotermní) organismy, k nimž patří člověk, činí 37 °C. Pro některé baktérie, žijící v extrémních podmínkách, však i optimální teplota (ale i optimální pH a optimální iontové složení) může dosahovat značně extrémních hodnot, např. některé mikroorganismy žijící v horkých přírodních pramenech mají optimální teplotu pro své enzymy blízkou bodu varu vody.U savčích enzymů však takové teploty leží již za optimální teplotou a kinetická energie enzymových molekul je tak velká, že překročí energetickou bariéru pro rozrušení sekundárních vazeb a interakcí, udržujících enzymovou molekulu v té konformaci (sekundární a terciární struktuře), která je pro enzymovou katalýzu nezbytná.Tím nastává denaturace provázená úbytkem až i ztrátou enzymové aktivity.

Test tepelné lability

(ale i lability vůči pH) patří k jednoduchým kritériím, zda daná reakce je enzymy katalyzována.

• U většiny savčích enzymů se tepelně denaturují enzymy již při 60 až 80 °C. Povařením se enzymy denaturují většinou velmi rychle.
• Závislost enzymové aktivity na vzrůstající teplotě lze vyjádřit graficky zvonovitou křivkou, která má vrchol u optimální teploty.

Závislost enzymové aktivity na pH

Závislost enzymové aktivity na pH je jiným významným činitelem, ovlivňujícím aktivitu enzymů. Také tuto závislost lze vyjádřit graficky zvonovitou křivkou s vrcholem u optimálního pH, které u většiny enzymů leží v rozmezí 5,0 až 9,0.

• Některé enzymy jsou však výjimkou, např. pepsin, působící v silně kyselém prostředí žaludeční šťávy, má optimální pH mezi 1,5 až 2,0.
• Vliv pH na vzrůst enzymové aktivity až do dosažení optimálního pH lze vyložit ovlivněním disociace ionizovatelných funkčních skupin substrátu i enzymu, které odpovídají za interakci enzymu se substrátem při tvorbě enzym-substrátového komplexu, ale i za udržování konformace enzymu. Krom toho se některé ionizovatelné funkční skupiny v aktivním centru podílejí na acidobazické katalýze. Protože enzymy jsou bílkovinné povahy, jsou stálé jako amfolyty jen v určitém rozmezí hodnot pH blízkém neutralitě.
• Extrémně kyselé nebo alkalické roztoky enzymy denaturují opět změnou konformace, podmíněné rozrušením sekundárních vazeb a interakcí, někdy i rozpadem kvartérní struktury na podjednotky nebo disociací nebílkovinné složky enzymu.

Vliv iontů na enzymy

Vliv iontů na enzymy je nejlépe patrný u některých dvojmocných kationtů (např. <chemform>Ca2+</chemform>, <chemform>Mg2+</chemform>, <chemform>Zn2+</chemform>) jako aktivátorů. Tyto ionty mohou vytvářet komplex se substrátem za tvorby metalosubstrátového komplexu, nebo komplex s enzymem, který pak váže substrát ve formě enzym-metalo-substrátového komplexu.

• Kovové ionty mohou měnit také rovnovážné stavy, ať už odstraňováním produktů ve formě komplexu s produktem reakce, nebo zvýšenou nabídkou substrátu, je-li účinnou formou metalo-substrátový komplex.
  • Jindy mohou kovy ovlivnit konformaci enzymového proteinu, udržovat kvartérní strukturu enzymu nebo mohou působit jako inhibitory vazbou na účinné skupiny aktivního centra (např. -SH skupiny jsou blokovány ionty <chemform>Hg2+</chemform>).
  • Některé kovové ionty se mohou podílet na mechanismu enzymově katalytické reakce interakcí se substrátem jako tzv. Lewisovy kyseliny (akceptory elektronových párů).
• Fluoridové ionty mohou zase působit inhibičně vazbou kationtů jako aktivátorů, např. vazbou <chemform>Ca2+</chemform> nebo <chemform>Mg2+</chemform>.
• Přítomnost solí může také nespecificky ovlivňovat aktivitu enzymu změnou iontové síly (např. ionty <chemform>Cl-</chemform>), a tím působit na hydrataci enzymového proteinu nebo na elektrokinetický potenciál, který mění pevnost iontových (elektrostatických) vazeb v molekule enzymu.

Stanovení enzymové aktivity

[editovat část] Enzymy jsou obsaženy v biologickém materiálu v tak nízkých koncentracích, že je nelze stanovit přímo. Naproti tomu lze s výhodou využít jejich substrátové specifičnosti a značné katalytické účinnosti při nepřímém stanovení kinetickou metodou, tj. na základě rychlosti, jakou enzym katalyzuje přeměnu substrátu na produkt ve zvoleném časovém intervalu.

Tato metoda je dostatečně specifická za předpokladu, že na substrát působí v daném materiálu jen jeden enzym. Je i dostatečně citlivá a přesná, je-li zvolena vhodná koncentrace substrátu vzhledem k enzymu a vhodná metoda stanovení úbytku substrátu nebo přírůstku produktu v čase, neboli vhodná metoda stanovení rychlosti přeměny substrátu na produkt.

Aby byla zajištěna srovnatelnost těchto změn v jednotlivých časových intervalech, je účelné, aby úbytek substrátu nebo přírůstek produktu v čase byl lineární, tj. aby reakce probíhala podle kinetiky nultého řádu, s konstantní rychlostí v. Toho by bylo dosaženo exaktně vzato jen tehdy, kdyby veškerý enzym byl substrátem nasycen, tj. kdyby veškerý enzym o celkové koncentraci e byl vázán ve formě enzym-substrátového komplexu ES, což je možné jen při velkém nadbytku substrátu. Pak probíhá enzymová reakce s maximální rychlostí V (V_max). Při zachování této podmínky lze určit i jednotky enzymové aktivity, protože při dvojnásobné koncentraci enzymu bude i maximální rychlost dvojnásobkem původní V apod.

Za podmínek určování V (V_max), tj. při značném nadbytku substrátu S, lze tedy kineticky stanovit e. Množství enzymu, správněji množství enzymové aktivity, pak vyjadřujeme v katalech. Toto novější vyjádření vychází, na rozdíl od staršího, ze základního látkového množství 1 mol a z časové jednotky 1 sekunda. Jako jednotka enzymové aktivity se tedy nyní označuje takové množství enzymové aktivity, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za sekundu. Tato nová jednotka se označuje katal (ve zkratce kat). Uvedená jednotka je ovšem pro praxi příliš veliká. Ve většině případů je vhodnější vyjádření v mikrokatalech (μkat) = 10^-6 kat, nanokatalech (nkat) = 10^-9 kat a pikokatalech (pkat) = 10^-12 kat.

Dříve se podle pravidel Mezinárodní biochemické unie (IUB) z r. 1961 užívalo pojmu enzymová jednotka (U) pro takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol substrátu za minutu za standardních podmínek (tj. nasycení enzymu substrátem, udaná teplota a pH). Odpovídající 1000× menší veličina byla milijednotka (mU), která obsahovala 1000 mikrojednotek (μU). Podle doporučení IUB z r. 1972 se však od pojmu množství enzymu upouští, protože tato definice se nehodí pro enzymy, které dosud nebyly izolovány.

Pojem množství tu nelze vždy ztotožnit s určitou fyzikálně-chemickou veličinou hmotnosti a jde tedy pouze o abstrakci vhodnou pro početní vyjádření. Namísto toho byly zavedeny pojmy: enzymová aktivita jako rychlost přeměny substrátu, která se dá přičíst na vrub enzymové katalýze; specifická aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek ke hmotnosti (např. k určitému množství tkáně, séra, enzymového preparátu); molová aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek k množství enzymové substance (byl-li enzym již izolován), které je zpravidla vyjádřeno v molech. Převod dosavadních enzymových jednotek (U) na kataly (kat) se řídí vztahem:

1 U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat

Avšak ve starší literatuře se ještě s pojmem enzymové jednotky (U) setkáváme. U nás byly zavedeny kataly do klinicko-biochemické laboratorní praxe povinně a výsledky laboratorních vyšetřeni jsou takto vyjadřovány v séru nejčastěji jako μkat/l.

Dosud jsme uvažovali sledování rychlostí za podmínek maximálního nasycení enzymu substrátem, tj. za podmínek maximální rychlosti V (V_max), která je tedy funkcí předpokládané koncentrace enzymu (je tím větší, čím je předpokládaná koncentrace enzymu větší). Kinetiky nultého řádu lze však aproximativně využít i tehdy, jestliže enzym substrátem nasycen není, tj. za různých i menších koncentrací substrátu, ovšem jen potud, pokud předpokládáme, že se výchozí koncentrace substrátu S v průběhu sledování reakce příliš nemění. To je možné jen tehdy, uvažujeme-li průběh reakce v prvých minutách reakce, kdy je úbytek výchozí koncentrace substrátu menší než zhruba jedna desetina původní hodnoty. V těchto případech předpokládáme tedy kinetiku nultého řádu pro tzv. iniciální rychlost v₀ , kdy můžeme pokládat koncentraci enzym-substrátového komplexu za stálou (steady-state). Při větším úbytku substrátu ovšem koncentrace ES klesá. Tím přechází kinetika nultého řádu do kinetiky prvého, druhého i vyššího řádu, tj. rychlost přeměny substrátu na produkt již není konstantní, ale stává se závislou na proměnné (klesající) aktuální koncentraci substrátu a zpomaluje se.

Pomocí iniciální rychlosti v₀ lze sledovat pro určité předpokládané množství enzymové aktivity vztah této rychlosti v₀ k určité výchozí koncentraci substrátu S (tj. sledování v za koncentrací nižších než je S odpovídající maximální rychlosti V pro předpokládanou celkovou koncentraci enzymu e). U téhož enzymu může být ovšem pojem vysoké a nízké koncentrace substrátu relativní a může se lišit podle typu substrátu. Abychom vyjádřili afinitu enzymu k určitému substrátu, užívá se veličiny, která je na aktuální celkové koncentraci enzymu nezávislá a je pro danou dvojici enzym-substrát charakteristickou konstantou. Je to tzv. Michaelisova konstanta (K_m), která označuje takovou látkovou koncentraci substrátu, při níž je rychlost enzymové reakce (v) polovinou rychlosti maximální (V), kdy je tedy

Její rozměr je mol/l a odpovídající menší jednotka mmol/l. Michaelis a Mentenová odvodili vztah mezi K_m, S, v a V:

Celkovou koncentraci substrátu s lze při iniciální rychlosti zhruba ztotožnit s koncentrací volného substrátu S, vyplývající z formulace ustáleného stavu (steady-state) komplexu ES v rovnici podle Michaelise-Mentenové. Nízká hodnota K_m značí velkou afinitu enzymu k substrátu. Vedle toho, že K_m charakterizuje daný enzym, je sledování K_m nezbytné též k odlišení mechanismu inhibice (nejčastěji typu kompetitivního nebo nekompetitivního). Ke grafickému znázornění K_m byla navržena úprava rovnice, kterou odvodili Lineweaver a Burk:

Tento výraz je možné upravit na výraz odpovídající rovnici přímky y = a · x + b .

Vynášíme-li: 1/v na osu y, 1/S na osu x, pak 1/V je průsečík na ose y a K_m/V je směrnice přímky, což značí, že 1/K_m je průsečík na ose x (v grafickém vyjádření zjišťujeme její zápornou hodnotu vlevo od počátku, viz obr.).

Tato metoda je však zatížena značnou chybou při nízkých koncentracích substrátu s. Je možno ji nahradit výpočtem z rovnice rovnoosé hyperboly. Grafickým vyjádřením této matematické závislosti je vynesení experimentálních hodnot v na ose y proti příslušným hodnotám S na ose x podle Eisenthala a Cornishe-Bowdena (viz obr.).

Pro každou dvojici hodnot se sestrojí přímka a v parametrickém prostoru lze dospět k hodnotám V a K_m, které by se v ideálním případě rovnoosé hyperboly zobrazily na průsečíku těchto přímek, kde V (V_max) je souřadnice y (ordináta) a K_m je souřadnice x (abscisa). V praxi se vzhledem k chybám měření přímky většinou protnou ve více průsečících. V případě lichého počtu hodnot se určí medián, tj. střední hodnota z hodnot uspořádaných podle velikosti, která má nad sebou i pod sebou stejný počet měrných hodnot. Při sudém počtu hodnot je medián aritmetickým průměrem dvou středních hodnot, tj. nejnižší hodnoty horní poloviny a nejvyšší hodnoty dolní poloviny hodnot uspořádaných podle velikosti.

Michaelisovu konstantu je ovšem možné vypočítat z rovnice rovnoosé hyperboly. Teoreticky vzato je nutné znát minimálně úsečky (abscisy) a pořadnice (ordináty) dvou bodů rovnoosé hyperboly dostatečně od sebe vzdálených. Jsou-li souřadnice jednoho krajního bodu S₁ a v₁ a druhého krajního bodu S₂ a v₂, pak platí rovnice:

            

Vzhledem k nepřesnostem měření se sestaví tabulka všech dvojic odpovídajích hodnot v příslušejících daným S. K_m nebo V se vypočte pro všechny možné páry dvojic a medián se vypočítá podobně jako v předchozí uvedené grafické metodě. Uvedené vztahy je možné vložit do programu počítače, který výpočet provede automaticky.

Jinou použitelnou grafickou metodou je vynesení podle Eadie-Hofsteeho. Vynáší se v na ose y proti v / S na ose x. V se vyhledá jako průsečík na ose y, V / K_m je průsečík na ose x a −K_m je směrnice zkonstruované přímky.

V současné době se však grafické metody používají jako doplňkové ke stanovení V_max, K_m a typu inhibice (pro reversibilní inhibici se rozlišuje inhibice kompetitivní, nekompetitivní, akompetitivní a smíšená) jako parametrů vypočtených metodami nelineární regrese pomocí počítačových programů.

Oxidoredukční enzymy (oxidoreduktasy EC 1)

[editovat část] Většina energie v živočišném organismu pochází z oxidoredukčních pochodů. Oxidační produkty reakce mají menší obsah energie než výchozí reagující látky a energie je uvolňována jako teplo, nebo je transformována na jiné druhy využitelné energie, např. na energii chemické vazby. Četné oxidace jsou spojeny s tvorbou „makroergických“ fosfátových esterů anhydridové povahy (ATP, ADP), jež mají zvláštní důležitost při konzervaci a přenosu energie. Vytvářejí se z energie uvolněné v buňce při oxidačních reakcích. Oxidoredukce mohou probíhat anaerobně, např. v glykolýze, nebo aerobně, např. při oxidaci substrátů citrátového (Krebsova) cyklu nebo β-oxidací mastných kyselin v mitochondriích.

Cukry, lipidy a bílkoviny představují zdroje energie v organismu, ale oxidace neprobíhají většinou přímo s molekulárním kyslíkem ani při aerobních oxidoredukcích (s výjimkou tzv. oxygenas).

Při oxidoredukčních pochodech v mitochondriích jsou přenášeny elektrony ze substrátů na kyslík řadou přenašečů, jež vytvářejí mezi sebou přesně navazující systém enzymů. Tento řetěz oxidoredukčních pochodů (buněčné dýchání) probíhá ve dvou stupních:

1. Přenos vodíkových atomů účinkem dehydrogenas, jež obsahují jako koenzym pyridin- a flavinnukleotidy.
2. Přenos elektronů zejména prostřednictvím cytochromů (v mitochondriích). Významný je poslední stupeň, kde autooxidabilní cytochromoxidasa reaguje přímo s molekulárním kyslíkem za tvorby molekul vody.

Oxidoredukční sled reakcí probíhá ve vnitřní mitochondriální membráně v tzv. dýchacím (respiračním) řetězu, který je velmi schematicky vyjádřen jako dvouelektronový přenos, neboť molekulám organických substrátů jsou elektrony prostřednictvím dehydrogenasových koenzymů při biologických oxidacích odnímány v párech. Na úrovni cytochromů je však přenos jednoelektronový a na úrovni cytochromoxidasy při redukci molekuly <chemform>O2</chemform> čtyřelektronový.

Při dvouelektronovém přenosu ze substrátů (nejčastěji) citrátového cyklu na molekulární kyslík se současně vytvářejí molekuly ATP – tzv. aerobní (oxidativní) fosforylace.

Akceptorem elektronů však nemusí být vždy kyslík. Některé dehydrogenasy odevzdávají elektrony i jiným akceptorům, např. pyruvátu (laktátdehydrogenasa) nebo in vitro i arteficiálním akceptorům, jako methylenová modř (flavinové dehydrogenasy). Jde tu o anaerobní oxidoredukce.

Vedle dehydrogenas a cytochromů patří k oxidoreduktasam (kromě jiných) také peroxidasa (EC 1.11.1.7) a katalasa (EC 1.11.1.6) rozkládající <chemform>H2O2</chemform> tak, že peroxidasa katalyzuje oxidaci vhodného substrátu

<chemform>AH2</chemform> + <chemform>H2O2</chemform> → 2 <chemform>H2O</chemform> + A ,

kdežto katalasa uvolňuje molekulární kyslík při reakci

2 <chemform>H2O2</chemform> → 2 <chemform>H2O</chemform> + <chemform>O2</chemform>

Warburgův optický test

[editovat část]

Když Otto Heinrich Warburg (1883–1970), německý biochemik a později nositel Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství (1931), poprvé využil ke sledování reakce katalyzované enzymem absorpčních vlastností pyridinových koenzymů, netušil patrně, jak významně se tento objev uplatní v klinické chemii. Převážná většina dnes rutinně používaných metod ke stanovení aktivity enzymů je založena přímo nebo nepřímo na fotometrii absorbance reakčních směsí, které obsahují pyridinový koenzym. Tento princip dal také metodě její označení „optický test“.

Reverzibilní hydrogenace nikotinamidadenindinukleotidu (<chemform>NAD+</chemform>), která nastává na pyridinovém kruhu nikotinamidu, vede k redukované formě (NADH + <chemform>H+</chemform>) a je provázena výraznou změnou absorpčního spektra. Zatímco oxidovaná forma (<chemform>NAD+</chemform>) má absorpční maximum při vlnové délce 260 nm, je zrušení aromatického charakteru pyridinového jádra a jeho přechod v chinoidní formu (NADH + <chemform>H+</chemform>) provázeno vznikem dalšího absorpčního maxima při 340 nm.

Velikost, případně změny absorbance při vlnové délce 340 nm jsou přímo úměrné počtu redukovaných molekul koenzymu. Přeměna jednoho molu koenzymu zase odpovídá přeměně jednoho molu substrátu, a navíc lze tuto přeměnu sledovat v čase, tedy kontinuálně měřit rychlost reakce pomocí spektrofotometru.

Tak je možné připravit reakční směs ze sledovaného enzymu (nebo biologického materiálu, v němž ho stanovujeme), koenzymu a příslušného substrátu v optimální koncentraci, a za optimálního pH i teploty zjišťovat reakční rychlost měřením změn absorbance na vhodném fotometru při vlnové délce 340 nm.

Spřažené reakce

Vzhledem ke skutečnosti, že <chemform>NAD+</chemform> je koenzymem jen některých dehydrogenas a že existuje řada klinicky významných enzymů z jiných tříd než jsou právě oxidoreduktasy, používá se vedle „jednoduchého optického testu“ ještě častěji „složených optických testů“, kdy se výše uvedeného principu využívá pouze jako indikátorové reakce, zatímco vlastní reakce měřící aktivitu příslušného enzymu je předřazena nebo dokonce spřažena v celou sérii s dalšími pomocnými reakcemi.

enzym	reakce	pomocná reakce	indikační reakce
alaninaminotransferasa EC 2.6.1.2	alanin + 2-oxoglutarát glutamát + pyruvát		LD: pyruvát + NADH + <chemform>H+</chemform> laktát + <chemform>NAD+</chemform>
kreatinkinasa EC 2.7.3.2	kreatinfosfát + ADP → kreatin + ATP	HK glukosa + ATP → Glc-6-P + ADP	Glc-6-PD Glc-6-P + <chemform>NADP+</chemform> 6-P-glukonát + NADPH + <chemform>H+</chemform>

Vysvětlivky:

LD – laktátdehydrogenasa (EC 1.1.1.27)

HK – hexokinasa (EC 2.7.1.1)

Glc-6-PD – glukosa-6-fosfátdehydrogenasa (EC 1.1.1.49)

Glc-6-P – glukosa-6-fosfát

Jako indikační reakce se také často používá peroxidasová reakce, např. při stanovení glukosy či cholesterolu.

analyt	reakce	indikační reakce
glukosa	GOD glukosa + <chemform>O2</chemform> → glukonová kyselina + <chemform>H2O2</chemform>	POD <chemform>H2O2</chemform> + fenol + 4-aminoantipyrin → chinonimin (růžový) + 4 <chemform>H2O</chemform>
cholesterol	CHE cholesterol + <chemform>O2</chemform> → 4-cholesten-3-on + <chemform>H2O2</chemform>	POD <chemform>H2O2</chemform> + fenol + 4-aminoantipyrin → chinonimin (růžový) + 4 <chemform>H2O</chemform>

Vysvětlivky:

GOD – glukosaoxidasa (EC 1.1.3.4)

CHE – cholesteroloxidasa (EC 1.1.3.6)

POD – peroxidasa (EC 1.11.1.7)