Komparativní genomová hybridizace
 | Článek byl zkontrolován učitelem | |||
| Tento článek byl zkontrolován učitelem. | ||||
| Podpis: doc. MUDr. Ondřej Šeda, PhD. | ||||
| Tuto šablonu smějí vkládat jen vyučující. | ||||
CGH (Comparative Genome Hybridization) je molekulárně – cytogenetická metoda umožňující analýzu celého genomu v jediném experimentu. CGH vychází z principů metody FISH (Fluorescence in situ hybridization) a z tohoto pohledu ji je možné definovat jako “ kvantitativní, dvojbarevnou, obrácenou “ FISH. To vypovídá o omezení jejího použití na detekci kvantitativních (nebalancovaných) změn genomu (amplifikace/delece), k čemuž je použito 2 vzorků DNA značených dvěma rozdílnými fluorochromy. Jako sonda je tedy využita DNA izolovaná z vyšetřované tkáně.
Obsah |
upravit Metoda
Po izolaci 2 vzorků DNA jsou tyto vzorky nick-translací označeny dvěma rozdílnými fluorochromy. Jedním vzorkem je DNA odebraná z vyšetřované tkáně, která je standardně značena zeleným fluorochromem. Druhým vzorkem je kontrolní (referenční) DNA značená červeným fluorochromem. Tyto sondy jsou pak společně hybridizovány s normálními chromozomy. Výsledek hybridizace je pak snímán fluorescenčním mikroskopem, karyotypován a počítačově vyhodnocen.
upravit Vyhodnocení
DNA vyšetřovaného jedince a referenční DNA v podstatě “kompetují“ o vazebná místa na chromozomech. V závislosti na tom, zda je určitý úsek vyšetřované DNA amplifikován, či deletován, pak ve výsledku v různých místech chromozomu převládá fluorochrom vyšetřované, nebo referenční DNA.
Počítačovou analýzou jsou získány hodnoty fluorescenčních intenzit vyšetřované a referenční DNA a je sestaven CGH profil v podobě křivky vyjadřující poměr intenzit obou fluorochromů v průběhu každého chromozomu.
upravit Poměr intenzit fluorescence
- = 1 → bez kvantitativní změny
- < 0,75 → delece
- > 1,25 → amplifikace, duplikace
upravit Použití
Metoda CGH nachází uplatnění především v onkocytogenetice při zjišťování nebalancovaných chromozomálních aberací u nádorů. Umožňuje identifikovat místa v genomu, kde došlo k delecím, nebo amplifikacím, a která tak mohou mít souvislost se vznikem či vývojem nádorového onemocnění.
upravit Výhody a nevýhody
upravit Výhody
- Mezi pozitiva metody patří možnost celogenomového screeningu bez potřeby kultivace buněk.
- Dále je to detekce aberantních míst bez předešlé znalosti jejich umístění v genomu.
upravit Nevýhody
- Jako nedostatky metody pak můžeme považovat nemožnost odhalit aberace, které nedoprovází kvantitativní změna genetického materiálu.
- Dále je limitující potřeba alespoň 50% zastoupení aberantních buněk ve vzorku.
- Z principu metody také vyplývá, že nelze odlišit diploidní a tetraploidní tumory.
- Limitující je pak i rozlišovací schopnost CGH, která činí 5 – 10 Mb.
Některé z těchto nedostatků řeší modifikace klasické metody CGH (viz. dále)
upravit Modifikace CGH
upravit HR – CGH (High Resolution CGH)
Tato metoda se od klasické CGH liší ve způsobu softwarového zpracování nasnímaného fluorescenčního obrazu. Je využito tzv. dynamických standardních referenčních intervalů namísto fixních. Východiskem dynamických referenčních intervalů je přirozená variabilita intenzit fluorescence každého chromozomového páru. Tyto hodnoty jsou zjištěny statistickým zpracováním odchylek kontrolních profilů u jedinců s normálním karyotypem.
Výhodou metody je rozlišení na úrovni 4-5 Mb a možnost odhalení aberací i při 20–30% klonálním zastoupení.
upravit Array CGH
Metoda využívá hybridizace fluorescenčně značených sond vyšetřované a referenční DNA s mnoha specifickými sekvencemi DNA namísto chromosomů, jak je tomu u klasické CGH. Každý z těchto malých úseků genomu má své přesné umístění v rámci mřížky, do které je rozčleněno podložní sklo (microarray, biočip) a mohou představovat jednotlivé geny či jejich části. Po hybridizaci s vyšetřovanou a referenční DNA je speciálním softwarem spočítán poměr fluorescence pro každý bod mřížky. Je tak možné analyzovat amplifikace nebo delece několika tisíc genů najednou, a to s rozlišovací schopností pod 100 kb. Tím se array CGH posouvá na úroveň molekulární diagnostiky.
upravit Odkazy
upravit Související články
upravit Externí odkazy
upravit Použitá literatura
- KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1.. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.
- NEČESALOVÁ, Eva. Využití metody HR-CGH pro molekulárně cytogenetickou charakterizaci nádorů mozku [online]. Brno, 2007, dostupné také z <http://is.muni.cz/th/41105/lf_d/Disertacni___prace.pdf>.
