Přímá diagnostika dědičných chorob analýzou nukleových kyselin
Z WikiSkript
Hodnoceno 3x, počet editací 7, počet autorů 6
Děkujeme za Vaše hodnocení (3★)
- umožňuje zachytit a identifikovat mutaci zodpovědnou za onemocnění u postižených a ve sledované rodině
- podmínkou je znalost lokalizace genu a znalost jeho standardní sekvence
- metody přímé diagnostiky pracují buď s oligonukleotidovými sondami nebo využívají metod sekvenování zkoumaného genu
- nabízejí možnost odhalení heterozygotního přenašeče mutované alely i u jedince, v jehož příbuzenstvu postižený jedinec není znám
Obsah |
upravit Metody testující jakoukoli odchylku od standardní sekvence DNA
upravit Analýza heteroduplexů
Podrobnější informace naleznete na stránce Heteroduplexová analýza.- založena na detekci chybného párování bazí (mismatch) při hybridizaci komplementárního vlákna DNA standardního a mutantního typu, kdy vznikají hybridní molekuly DNA – heteroduplexy
- vytvářejí se v místech s delecemi nebo inzercemi několika bazí
- principem je rozdílná elektroforetická mobilita dsDNA v případě dokonalé a nedokonalé komplementarity
upravit SSCP metoda
Podrobnější informace naleznete na stránce SSCP.- Single Strand Conformation Polymorphism Analysis
- založena na analýze ssDNA (jednovláknová DNA)
- využívá PCR
- amplifikovaný úsek DNA je denaturován a nanesen na polyakrylový gel
- je-li ve vyšetřovaném úseku DNA přítomna mutace, jednovláknová DNA zaujme odlišnou konformaci (odlišná pohyblivost této DNA v gelu)
- vlákna je možné vizualizovat – radioaktivní značení oligonukleotidů pro PCR
upravit DGGE
Podrobnější informace naleznete na stránce DGGE.- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
- vychází z rozdílného bodu tání v závislosti na složení dsDNA
- heteroduplexy a homoduplexy – migrují při elektroforese gelem s lineárně se zvyšujícím množstvím denaturačních činidel
- v místě, kde koncentrace denaturačních činidel odpovídá teplotě, při které dochází k částečné denaturaci DNA, se migrace parciálně denaturovaného úseku DNA značně zpomalí nebo zastaví
- DNA heteroduplexy jsou méně stabilní a proto se jejich vlákna částečně separují dříve než vlákna homoduplexů – zpomalí svou mobilitu v gelu a migrují do jiné pozice
upravit Chemické nebo enzymatické štěpení heteroduplexů
- technika mismatch cleavage
- štěpení jednovláknového místa – tam, kde není úplná komplementarita obou vláken
- elektroforesa v denaturovaném gelu – průkaz přítomnosti štěpených nebo neštěpených fragmentů testované DNA
upravit PTT
- Protein Truncation Test
- metoda specifická pro detekci mutací, které mají za následek vznik předčasného terminačního kodonu a tím zkrácení proteinového produktu
- izolovaná mRNA → reversní transkripce → PCR → cDNA → transkripce a translace in vitro → velikost proteinového produktu testována elektroforeticky a srovnána s délkou standardního produktu
upravit Sekvenování
Podrobnější informace naleznete na stránce Sekvenování.- využití zejména v závěrečné fázi vyšetření
upravit Metody detekce specifických mutací
- lze je použít tam, kde má většina postižených v populaci jednu nebo omezený počet mutací – př. srpkovitá anémie, CF
upravit Mutačně-specifická analýza RFLP
- v případě, kdy mutace vytváří nebo ruší místo pro určitý restrikční enzym
- PCR → amplifikace úseku DNA s restrikčním místem → restrikce specifickými restrikčními enzymy → gelová elektroforesa
upravit ASO
- Alelově Spegifické Oligonikleotidy
- syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA
upravit Diagnostika expanze trinukleotidů
- amplifikace (PCR) oblasti genu s obsahem repetic (CAG)n → elektroforéza v polyakrylamidovém gelu → počet repetic souvisí s rozvojem onemocnění
- př. Huntingtonova chorea
upravit Odkazy
upravit Související články
upravit Zdroj
ŠTEFÁNEK, Jiří. Medicína, nemoci, studium na 1. LF UK [online]. [cit. 2009]. <http://www.stefajir.cz>.
