Stanovení enzymové aktivity

Enzymy jsou obsaženy v biologickém materiálu v tak nízkých koncentracích, že je nelze stanovit přímo. Naproti tomu lze s výhodou využít jejich substrátové specifičnosti a značné katalytické účinnosti při nepřímém stanovení kinetickou metodou, tj. na základě rychlosti, jakou enzym katalyzuje přeměnu substrátu na produkt ve zvoleném časovém intervalu.

Tato metoda je dostatečně specifická za předpokladu, že na substrát působí v daném materiálu jen jeden enzym. Je i dostatečně citlivá a přesná, je-li zvolena vhodná koncentrace substrátu vzhledem k enzymu a vhodná metoda stanovení úbytku substrátu nebo přírůstku produktu v čase, neboli vhodná metoda stanovení rychlosti přeměny substrátu na produkt.

Aby byla zajištěna srovnatelnost těchto změn v jednotlivých časových intervalech, je účelné, aby úbytek substrátu nebo přírůstek produktu v čase byl lineární, tj. aby reakce probíhala podle kinetiky nultého řádu, s konstantní rychlostí v. Toho by bylo dosaženo exaktně vzato jen tehdy, kdyby veškerý enzym byl substrátem nasycen, tj. kdyby veškerý enzym o celkové koncentraci e byl vázán ve formě enzym-substrátového komplexu ES, což je možné jen při velkém nadbytku substrátu. Pak probíhá enzymová reakce s maximální rychlostí V (V_max). Při zachování této podmínky lze určit i jednotky enzymové aktivity, protože při dvojnásobné koncentraci enzymu bude i maximální rychlost dvojnásobkem původní V apod.

Za podmínek určování V (V_max), tj. při značném nadbytku substrátu S, lze tedy kineticky stanovit e. Množství enzymu, správněji množství enzymové aktivity, pak vyjadřujeme v katalech. Toto novější vyjádření vychází, na rozdíl od staršího, ze základního látkového množství 1 mol a z časové jednotky 1 sekunda. Jako jednotka enzymové aktivity se tedy nyní označuje takové množství enzymové aktivity, které katalyzuje přeměnu 1 molu substrátu za sekundu. Tato nová jednotka se označuje katal (ve zkratce kat). Uvedená jednotka je ovšem pro praxi příliš veliká. Ve většině případů je vhodnější vyjádření v mikrokatalech (μkat) = 10^-6 kat, nanokatalech (nkat) = 10^-9 kat a pikokatalech (pkat) = 10^-12 kat.

Dříve se podle pravidel Mezinárodní biochemické unie (IUB) z r. 1961 užívalo pojmu enzymová jednotka (U) pro takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol substrátu za minutu za standardních podmínek (tj. nasycení enzymu substrátem, udaná teplota a pH). Odpovídající 1000× menší veličina byla milijednotka (mU), která obsahovala 1000 mikrojednotek (μU). Podle doporučení IUB z r. 1972 se však od pojmu množství enzymu upouští, protože tato definice se nehodí pro enzymy, které dosud nebyly izolovány.

Pojem množství tu nelze vždy ztotožnit s určitou fyzikálně-chemickou veličinou hmotnosti a jde tedy pouze o abstrakci vhodnou pro početní vyjádření. Namísto toho byly zavedeny pojmy: enzymová aktivita jako rychlost přeměny substrátu, která se dá přičíst na vrub enzymové katalýze; specifická aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek ke hmotnosti (např. k určitému množství tkáně, séra, enzymového preparátu); molová aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek k množství enzymové substance (byl-li enzym již izolován), které je zpravidla vyjádřeno v molech. Převod dosavadních enzymových jednotek (U) na kataly (kat) se řídí vztahem:

1 U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat

Avšak ve starší literatuře se ještě s pojmem enzymové jednotky (U) setkáváme. U nás byly zavedeny kataly do klinicko-biochemické laboratorní praxe povinně a výsledky laboratorních vyšetřeni jsou takto vyjadřovány v séru nejčastěji jako μkat/l.

Dosud jsme uvažovali sledování rychlostí za podmínek maximálního nasycení enzymu substrátem, tj. za podmínek maximální rychlosti V (V_max), která je tedy funkcí předpokládané koncentrace enzymu (je tím větší, čím je předpokládaná koncentrace enzymu větší). Kinetiky nultého řádu lze však aproximativně využít i tehdy, jestliže enzym substrátem nasycen není, tj. za různých i menších koncentrací substrátu, ovšem jen potud, pokud předpokládáme, že se výchozí koncentrace substrátu S v průběhu sledování reakce příliš nemění. To je možné jen tehdy, uvažujeme-li průběh reakce v prvých minutách reakce, kdy je úbytek výchozí koncentrace substrátu menší než zhruba jedna desetina původní hodnoty. V těchto případech předpokládáme tedy kinetiku nultého řádu pro tzv. iniciální rychlost v₀ , kdy můžeme pokládat koncentraci enzym-substrátového komplexu za stálou (steady-state). Při větším úbytku substrátu ovšem koncentrace ES klesá. Tím přechází kinetika nultého řádu do kinetiky prvého, druhého i vyššího řádu, tj. rychlost přeměny substrátu na produkt již není konstantní, ale stává se závislou na proměnné (klesající) aktuální koncentraci substrátu a zpomaluje se.

Pomocí iniciální rychlosti v₀ lze sledovat pro určité předpokládané množství enzymové aktivity vztah této rychlosti v₀ k určité výchozí koncentraci substrátu S (tj. sledování v za koncentrací nižších než je S odpovídající maximální rychlosti V pro předpokládanou celkovou koncentraci enzymu e). U téhož enzymu může být ovšem pojem vysoké a nízké koncentrace substrátu relativní a může se lišit podle typu substrátu. Abychom vyjádřili afinitu enzymu k určitému substrátu, užívá se veličiny, která je na aktuální celkové koncentraci enzymu nezávislá a je pro danou dvojici enzym-substrát charakteristickou konstantou. Je to tzv. Michaelisova konstanta (K_m), která označuje takovou látkovou koncentraci substrátu, při níž je rychlost enzymové reakce (v) polovinou rychlosti maximální (V), kdy je tedy

Její rozměr je mol/l a odpovídající menší jednotka mmol/l. Michaelis a Mentenová odvodili vztah mezi K_m, S, v a V:

Celkovou koncentraci substrátu s lze při iniciální rychlosti zhruba ztotožnit s koncentrací volného substrátu S, vyplývající z formulace ustáleného stavu (steady-state) komplexu ES v rovnici podle Michaelise-Mentenové. Nízká hodnota K_m značí velkou afinitu enzymu k substrátu. Vedle toho, že K_m charakterizuje daný enzym, je sledování K_m nezbytné též k odlišení mechanismu inhibice (nejčastěji typu kompetitivního nebo nekompetitivního). Ke grafickému znázornění K_m byla navržena úprava rovnice, kterou odvodili Lineweaver a Burk:

Tento výraz je možné upravit na výraz odpovídající rovnici přímky y = a · x + b .

Vynášíme-li: 1/v na osu y, 1/S na osu x, pak 1/V je průsečík na ose y a K_m/V je směrnice přímky, což značí, že 1/K_m je průsečík na ose x (v grafickém vyjádření zjišťujeme její zápornou hodnotu vlevo od počátku, viz obr.).

Tato metoda je však zatížena značnou chybou při nízkých koncentracích substrátu s. Je možno ji nahradit výpočtem z rovnice rovnoosé hyperboly. Grafickým vyjádřením této matematické závislosti je vynesení experimentálních hodnot v na ose y proti příslušným hodnotám S na ose x podle Eisenthala a Cornishe-Bowdena (viz obr.).

Pro každou dvojici hodnot se sestrojí přímka a v parametrickém prostoru lze dospět k hodnotám V a K_m, které by se v ideálním případě rovnoosé hyperboly zobrazily na průsečíku těchto přímek, kde V (V_max) je souřadnice y (ordináta) a K_m je souřadnice x (abscisa). V praxi se vzhledem k chybám měření přímky většinou protnou ve více průsečících. V případě lichého počtu hodnot se určí medián, tj. střední hodnota z hodnot uspořádaných podle velikosti, která má nad sebou i pod sebou stejný počet měrných hodnot. Při sudém počtu hodnot je medián aritmetickým průměrem dvou středních hodnot, tj. nejnižší hodnoty horní poloviny a nejvyšší hodnoty dolní poloviny hodnot uspořádaných podle velikosti.

Michaelisovu konstantu je ovšem možné vypočítat z rovnice rovnoosé hyperboly. Teoreticky vzato je nutné znát minimálně úsečky (abscisy) a pořadnice (ordináty) dvou bodů rovnoosé hyperboly dostatečně od sebe vzdálených. Jsou-li souřadnice jednoho krajního bodu S₁ a v₁ a druhého krajního bodu S₂ a v₂, pak platí rovnice:

            

Vzhledem k nepřesnostem měření se sestaví tabulka všech dvojic odpovídajích hodnot v příslušejících daným S. K_m nebo V se vypočte pro všechny možné páry dvojic a medián se vypočítá podobně jako v předchozí uvedené grafické metodě. Uvedené vztahy je možné vložit do programu počítače, který výpočet provede automaticky.

Jinou použitelnou grafickou metodou je vynesení podle Eadie-Hofsteeho. Vynáší se v na ose y proti v / S na ose x. V se vyhledá jako průsečík na ose y, V / K_m je průsečík na ose x a −K_m je směrnice zkonstruované přímky.

V současné době se však grafické metody používají jako doplňkové ke stanovení V_max, K_m a typu inhibice (pro reversibilní inhibici se rozlišuje inhibice kompetitivní, nekompetitivní, akompetitivní a smíšená) jako parametrů vypočtených metodami nelineární regrese pomocí počítačových programů.