Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku

Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species) a reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species), souhrnně označované RONS (Reactive Oxygen and Nitrogen Species), zahrnují jak volné radikály, tak i látky, které volnými radikály nejsou (proto je termín reaktivní formy kyslíku přesnější a správnější než označení kyslíkové radikály). Jako volný radikál označujeme jakoukoliv chemickou entitu, atom, molekulu nebo ion, která má ve vnější sféře svého elektronového obalu alespoň jeden nespárovaný elektron (→ je hodně reaktivní) a je přitom schopna samostatné existence.

Reaktivní formy:

• reagují s MK, lipidy, AMK, proteiny, mono a polynukleotidy (NK), s řadou nízkomolekulárních metabolitů, s koenzymy atd.
• jsou významnými prostředníky přenosu energie, faktory imunitní ochrany, signální molekuly buněčné regulace;
• za patologických podmínek většinou působí toxicky.
• Vznik:

a. homolytické štěpení kovalentní vazby – nutno dodat velké množství energie;

b. redukce – přidání jednoho e^-;

c. oxidace – ztráta jednoho e^-.

• Vznik radikálů může být iniciací radikálové řetězové reakce, reakce se pak propaguje do okolí, dokud nenarazí na další radikál – terminace.

Obsah 1 Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species) 1.1 Zdroje ROS 1.1.1 Superoxid 1.1.2 Peroxid vodíku 1.2 Místa tvorby 2 Reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species) 2.1 Oxid dusnatý 2.2 Peroxynitrit 2.3 Zdroje RNS 2.3.1 Oxid dusnatý 3 Poškození biomolekul 4 Poškození enzymových komplexů a buněčné signalizace 4.1 Lipidy 4.2 Proteiny 4.3 DNA 5 Volné radikály při vzniku chorob 5.1 Nekróza 5.2 Apoptóza 5.3 Ischemie nebo hypoxie 5.4 Reperfuze 5.5 ROS v zánětu 5.6 RNS v zánětu 5.7 Diabetes 5.8 Ateroskleróza 5.9 Další 6 Odkazy 6.1 Související články 6.2 Použitá literatura

upravit Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species)

• Delší vdechovaní čistého kyslíku působí na člověka toxicky.
• Toxicita kyslíku:
  • reaktivní formy – tvoří se i při normálním zásobování kyslíkem;
  • pro některé děje v organismu nezbytné.
• Reaktivní formy jsou volné radikály vytvořené z molekuly kyslíku, které obsahují nepárový elektron a sloučeniny kyslíku, které nemají charakter radikálů, ale ty z nich mohou vznikat.

1. Volné radikály (volné kyslíkové radikály, VKR):
   • Superoxid – O₂^•-
   • Hydroxylový radikál – HO^•
   • Peroxyl – ROO^•
   • Alkoxyl – RO^•
   • Hydroperoxyl – HO₂^•
2. Látky, které nejsou volnými radikály:
   • Peroxid vodíku – H₂O₂
   • Kys. chlorná – HClO
   • Ozon – O₃
   • Singletový kyslík – ¹O₂

• Jednoelektronovou redukcí kyslíku = superoxid O₂^•− (superoxidový anion – záporný náboj, radikál – nepárový elektron);
  • schopen dismutovat (vykazovat jak oxidační tak redukční vlastnosti při vzájemné reakci);
  • probíhá spontánně;
  • v organismu urychlována enzymem superoxiddismutázou.
• Peroxid vodíku pak může spolu s superoxidem v přítomnosti Fe²⁺ nebo Cu⁺ tvořit hydroxylový radikál, vysoce reaktivní formu vytvařející např. lipoperoxidy;
  • reakce peroxidu vodíku s chloridy katalyzovanou myeloperoxidázou v granulocytech, kde vznikají silná oxidační činidla – chlornany;
  • může se protonizovat na hydroperoxylový radikál;
  • může přijmout další elektron a 2 protony za vzniku peroxidu vodíku;
  • nemá nepárový elektron, není radikálem, účastní se ale radikálových reakcí;
  • v přítomnosti tranzitních kovů (Fe²⁺, Cu⁺) se H₂O₂ redukuje Fentonovou reakcí a vzniká vysoce aktivní a toxický hydroxylový radikál – Fentonova reakce:

<chemform>H2O2</chemform> + <chemform>Fe2+</chemform> ——→ HO^• + OH⁻ + <chemform>Fe3+</chemform>

• • V přítomnosti dalšího elektronu a protonu se rozpadne na vodu a na hydroxylový radikál.

• Excitací elektronu v molekule kyslíku spojenou se změnou spinu jednoho z vnějších elektronů vzniká reaktivní forma = singletový kyslík;
  • vzniká z O₂ působením vysoceenergetického zdroje (záření);
  • reaguje rychle s MK za vzniku lipidových peroxidů.

• • v dýchacím řetězci probíhá základní čtyřelektronová redukce molekulárního kyslíku na 2 molekuly vody
    • přijetím 1. e^-: O₂ ——→ O₂^•-
    • přijetím 2. e^-: O₂^•- ——→ H₂O₂
    • přijetím 3. e^-: H₂O₂ ——→ H₂O + HO^• – nejreaktivnější z ROS radikálů
    • přijetím 4. e^-: HO^• ——→ H₂O
  • Tato reakce probíhá v aktivním centru cytochromoxidázy v mitochondriích (respirační řetězec).

Kyselina chlorná (HClO)

• je syntetizována granulocyty (pomocí myeloperoxidasy):

Nejprve vzniká superoxid účinkem granulocytární NADPH-oxidázy:

<chemform>O2</chemform> + NADPH —→ O₂·⁻ + <chemform>NADP+</chemform>

Dismutací superoxidu vznikne peroxid vodíku <chemform>H2O2</chemform>, a ten následně oxiduje chloridové anionty na kyselinu chlornou:

<chemform>H2O2</chemform> + <chemform>Cl-</chemform> —→ HClO + <chemform>OH-</chemform>

• Silný oxidant – baktericidní.

upravit Zdroje ROS

upravit Superoxid

• Mitochondrie – v nich je nejvýznamnější zdroj superoxidu – respirační řetězec;
  • primárně se tvoří superoxid, sekundárně peroxid vodíku;
  • hlavní producent ROS v respirač. řetězci – komplex I, komplex III.
• Endoplasmatické retikulum
  • superoxid vzniká z oxokomplexu cytochromu P450;
• Leukocyty, makrofágy
  • superoxid vzniká při vzniku baktericidních látek NADPH-oxidázou, která tyto reakce katalyzuje;
  • produkují také HClO (myeloperoxidázou);
  • indukují také tvorbu NO^• a tím vlastně tvorbu peroxynitritu;
  • všechny tyto látky jsou používány proti cizím strukturám (bakterie,…).
• Erytrocyty
  • v malém množství vzniká superoxid při oxidaci Hb na metHb → erytrocyty usilují zejména o ochranu vlastních struktur proti radikálům.

upravit Peroxid vodíku

• Vzniká hlavně dismutací superoxidu;
• též tvořen dvouelektronovou redukcí kyslíku působením oxidáz (monoaminooxidáza, glutathionoxidáza, xanthinoxidáza);
• xanthinoxidáza (dehydrogenasova forma – D forma – nejčastější v organismu) – oxiduje substráty a e^- předává na NAD⁺, který je tím redukován. V patologické situaci se D forma konvertuje na O formu, která není schopná předávat e^- na NAD⁺ a ty se pak předají na kyslík, z něhož vznikne:
  • superoxid (jednoelektronovou redukcí O₂);
  • peroxid vodíku (dvouelektronovou redukcí O₂).

upravit Místa tvorby

• Enzymové, neenzymové reakce:

1. příkladem hypoxantin – oxiduje se xantinoxidasou na kyselinu močovou;
2. vznik chlornanů v neutrofilních granulocytech;
3. tvoří se tam, kde se kyslík setkává s chinony a katecholaminy z toxických látek s nitroaromatickými sloučeninami či tetrachlormetanem;
4. při syntéze eikosanoidů;
5. fagocytující buňky produkující hodně volných radikálů – během fagocytózy se spotřebuje vysoký počet molekul kyslíku = respirační vzplanutí;
6. za přítomnosti vysokoenergetického záření (elektrické pole, jiskření, elektromagnetické pole, UV záření, laser, polarizované světlo) v ovzduší ze smogu a výfukových plynů nebo cigaretového kouře.

upravit Reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species)

1. Volné radikály:
   • Oxid dusnatý – NO^•
   • Oxid dusičitý – NO₂^•
2. Látky, které nejsou volnými radikály:
   • Nitrosyl – NO⁺
   • Nitroxid – NO
   • Peroxynitrit – ONOO
   • Alkylperoxynitrit – ROONO

• Do této skupiny patří NO^• a jeho metabolity.

upravit Oxid dusnatý

• Krátký biologický poločas – je vychytáván erytrocyty, v kterých reaguje s Hb za vzniku methemoglobinu a nitrátu.
• Dobře se váže na hemové železo guanylátcyklázy, (podstata stimulace cGMP, vedoucí k myorelaxaci).

upravit Peroxynitrit

• Nejvýznamnější toxický produkt oxidu dusnatého.
• Vzniká reakcí NO^• se superoxidem.

NO^• + O₂^•- ——→ OONO^-

• Je oxidačním činidlem.
• Obecně – nejvýkonnějším producentem volných radikálů v buňkách – membránově vázané enzymy, jejíchž koenzymy jsou schopné redukovat kyslík jediným e^- na superoxid.

upravit Zdroje RNS

upravit Oxid dusnatý

• k syntéze potřebuje:
  • 4 kofaktory (Hem, FAD, FMN, H4-biopterin);
  • 2 kosubstráty (O₂, NADPH);
  • NO synthasy (NOS – nitric oxide synthases) – katalyzují syntézu NO;
  • NOS I (ncNOS – mozková, konstitutivní);
  • NOS II (iNOS).
    • Je to enzym makrofágů, neutrofilů, hepatocytů, chondrocytů, buněk cévní svaloviny, buněk Langerhansových ostrůvků;
    • exprese genu pro NOS II je stimulována cytokiny, mikroby;
  • NOS III (ecNOS – endotelová, konstitutivní);
    • tvoří tzv. EDRF – má vazodilatační účinek, jde o oxid dusnatý.

upravit Poškození biomolekul

• Hlavní buněčné cílové struktury pro volné radikály jsou:

1. Nenasycené MK v lipidech (buněčné membrány) - poškození: ztráta dvojných vazeb, tvorba reaktivní metabolitů (peroxidy, aldehydy) následky: změna fluidity a propustnosti membrán, tvorba chemoreaktivních látek pro mikrofágy.
2. Proteiny - poškození: agregace, síťování, fragmentace, štěpení, reakce s hemovým Fe, modifikace triolových skupin a benzenových jader AMK následky: změny v transportu iontů, vstup Ca²⁺ do cytosolu, změny v aktivitě enzymů.
3. DNA - poškození: štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce následky: mutace, translační chyby, inhibice proteosyntézy.

upravit Poškození enzymových komplexů a buněčné signalizace

upravit Lipidy

• Nejdůležitější reakce – peroxidace lipidů
  • takové změny nejintenzivněji vyvolávají hydroperoxylový a hydroxylový radikál, zvláště superoxid;
  • nejcitlivější terč – fosfolipidová dvojvrstva membrán a v nich hlavně místa dvojných vazeb nenasycených MK a to kyseliny linolové a linoleové;
  • membrány postižené lipoperoxidací – změna permeability, vedlejší produkt je malondialdehyd, stanovení odpovídá míře lipoperoxidace;
  • už vzniklé peroxidy se likvidují glutathionperoxidázou;
  • projev oxidačního poškození lipidů – pigment ve stařeckých skvrnách.
• Každá látka, která má dostatečnou afinitu k elektronům a dokáže vytrhnout vodíkový atom z methylenové skupiny uhlovodíkového řetězce MK, může zahájit radikálovou reakci a MK nebo lipid se stává radikálem;
• po vytržení vodíku (iniciace), vzniká konjugovaný dién (mezi dvěma dvojnými vazbami vzniká jedna jednoduchá), který snadno reaguje s O₂ za vzniku peroxylového radikálu (LOO^•);
• peroxylový radikál vytrhne ֿe^- z MK sousedícího lipidu, z něhož vznikne nový radikál a z peroxylového radikálu vznikne hydroperoxid (LOOH);
• reakce se propaguje, dokud se radikál nesetká s dalším radikálem nebo vitaminem E, kdy se reakce zastaví tím, že vznikne stála sloučenina (terminace radikálové reakce);
• výsledek: hydroperoxidy a cyklické peroxidy MK (poměrně stálé) – když se však potkají s tranzitním kovem (Fe), mění se na alkoxylové radikály LO^•.
• Rozeznáváme dva typy peroxidace:
  • neenzymová – škodí;
    • často vyvolaná patologickým faktorem;
    • výsledek – směs různých produktů způsobujících škody (vážou se na proteiny, mění fluiditu membrán, zvyšují propustnost pro ionty, snižují membránový potenciál);
  • enzymová – fyziologická;
    • probíhá v aktivních centrech hydroperoxidáz a endoperoxidáz (cyklooxygenáza, lipoxygenáza);
    • volné radikály jsou přirozené meziprodukty těchto reakcí, jsou ale vázané na enzym, čili nepůsobí problémy.

upravit Proteiny

• volné radikály:
  • oxidují AMK zbytky – ztráta enzymové aktivity, signální nebo transportní fce
  • hydroxylace proteinů – hydroxylovým radikálem
  • nitrace – peroxynitritem (zejména Phe, Tyr, Trp)
• peroxidace lipidů:
  • vede k agregací a síťování membránových proteinů a lipoproteinových částic v důsledku tvorby radikálů během těchto peroxidací
• Fe:
  • lyzylový zbytek slouží jako ligand schopný vázat Fe²⁺, čili s peroxidem dává Fentonovou reakci
• HO^•
  • vzniká modifikovaný protein, který je následně odstraňován proteasami
  • následky – enzymy mění svojí aktivitu, selhávají proteinové pumpy, v cytosolu se hromadí Ca²⁺,čímž se aktivují proteasy a fosfolipasy, dochází ke vzniku nových antigenních determinant a autoimunitních reakcí, …

upravit DNA

• hlavně hydroxylovým radikálem – modifikuje a uvolňuje purinové a pyrimidinové báze
• hydroxylový radikál:
  • vyjímá vodíkový radikál z deoxyribosy
  • je schopný se adovat k bázím a měnit je na hydroxy- a oxoderiváty
• následky: chybné párování, přerušení řetězce
• projevy: apoptóza, metageneze, karcinogeneze, stárnutí
• HO^• – uvolňuje Fe z enzymových center a tím mění aktivitu daných enzymů
• NO^• – váže se na železo v aktivních centrech enzymů a tím je inaktivuje (katalasa, cytochrom P450)
• Nitrace strukturních proteinů (aktin, neurofilamenta, …) – funkční následky v buněčném transportu a mobilitě

upravit Volné radikály při vzniku chorob

upravit Nekróza

• příčina: oxidační stres, ischemie, vyčerpání GSH
• výsledek: poškození membrán, bobtnání organel, lýza buňky

upravit Apoptóza

• může být zahájena vzestupem produkce ROS
• zdroj ROS – respirační řetězec => proto hlavní spouštěcí faktory apoptózy lokalizovány v mitochondriích
• cytochrom c:
  • kromě přenášení e^- v respiračním řetězci se uvolňuje z mitochondriální membrány a plní antioxidační funkce (oxiduje superoxid, unikající z komplexu I a III a získané e^- předává na komplex IV => tím zabrání tvorbě superoxidu).
  • Nestačí-li mechanizmus zvládnout nápor superoxidu, cytochrom c proniká pomocí faktoru Bax přes zevní mitochondriální membránu do cytosolu, kde aktivuje apoptotickou proteolytickou kaskádu.
  • Aktivují se proteázy – kaspázy => fragmentace buněčného jádra atd.

upravit Ischemie nebo hypoxie

• kyslík a ROS – hlavní patogenické faktory reperfuzního poškození tkáně.
• vázne přenos elektronů v respiračním řetězci a:
  • klesne ATP
  • hromadí se AMP a jeho oxidační metabolit hypoxantin
  • selhává membránový transport iontů, stoupne vápník v cytosolu
  • aktivují se geny pro syntézu stresových proteinů (heat shock proteins – HSP), které se jakožto chaperony navazují na nové (navozují správnou konformaci při rekonstrukci poškozených organel) i poškozené (pomáhají při odstraňování poškozených proteinů) proteiny.

upravit Reperfuze

• na začátku se v tkáni začne tvořit velké množství ROS, jejichž zdrojem jsou:

1. xantinooxidasa
   • endotelová – během ischemie se konvertuje XOR na XOD (schopná tvořit ROS)
   • parenchynová a sliznični XOD
     • tvořena některými orgány (játra, střevo)
     • také produkuje ROS
   • kyslík (z obnovené cirkulace) a nahromadený hypoxantin jsou substráty xantinoxidasy k tvorbě superoxidu a peroxidu vodíka.
2. neutrofily
   • ROS indukují syntesu adhezivních molekul v endotelových buňkách (selektíny, ICAM – 1) => neutrofily adherují k endotelu, prostupují do intersticia a produkují další ROS.
   • alopurinol zabraňuje hromadení neutrofilu v ischemické tkáni
3. redukovaný respirační řetězec
4. zvýšené uvolňování železa z feritinu
5. zvýšená koncentrace cytosolového kalcia
   • aktivuje fosfolipasu A₂ => aktivace cyklooxigenasové a lipoxinasové cesty, při kterých též vznikají ROS
   • aktivuje syntézu NO a proteasy konvertující XOR na XOD.

• ischemie a reperfuze indukují tvorbu řady cytokinů (IL-1, IL-6, TGF-beta) – ty aktivují neutrofily k produkci superoxidu a kyseliny chlorné => rozvoj zánětu a oxidačního poškození
• intenzivní nedostatek kyslíku způsobí nekrózu, mírnější a protrahovanější nedostatek navodí apoptózu

zánět:

upravit ROS v zánětu

• rozhodující producent ROS v aktivovaných fagocytech – membránový enzymový systém NADPH-oxidasy
  • schopná zvýšit produkci volných radikálů stimulací Fc-receptoru, receptoru pro C3b- složku komplementu
  • její aktivace vede k přesunu cytosolových komponent enzymu k plazmatické membráně a k vytvoření membránově vázaného makromolekulárního komplexu
  • aktivace fagocytů a stimulace NADPH-oxidasy způsobí vzestup spotřeby kyslíku fagocytem – respirační vzplanutí (respiratory burst)
  • jejím působením se tedy kyslík redukuje na superoxid (donor e^-)
  • regeneruje se v pentosafosfátovém cyklu – proto respirační vzplanutí zahrnuje i vzestup oxidace glukózy
  • následně ze superoxidu vzniká peroxid vodíku, hydroxylový radikál

Působením myeloperoxidasy se tvoří chloridivý anion (ten dáva s H₂O₂ chlornanové ionty – reakci s aminy pak chloraminy – oba typy mají mikrobicidní účinek)

upravit RNS v zánětu

• nejvíce se objevuje NO^• – vzniká působením NO-syntasy – ta je při zánětu aktivovaná endotoxinem v makrofázích prostředníctvím aktivace transkripčniho faktoru NF-κB
• NO^• – stimuluje guanylátcyklasu v hl.svalových buňkách a stimuluje vazodilataci (typické prokrvení tkáně v místě zánětu)
• NO^• – reakcí se superoxidem vytváří peroxynitrit – k zabíjení intracelulárních patogenů
• NO^• – s thioly z tkáňových AMK vytváří S-nitrosothioly – antimikrobní účinky

upravit Diabetes

• citlivě reagují beta buňky pankreatu
• nalezena snížená hladina přirozených antioxidantů v krvi
• předpokládá se, že radikály působí škodlivě na cévní endotel v některých tkáních, a tak se stávají příčinou cévních komplikací diabetu
• dochází také k zánětům pankreatu s poškozením jeho beta buněk (asi původ v oxid.stresu)
• poškozují proteinové faktory, které drží v rovnováze plicní elastasu – usnadní se štěpení elastinu v přepážkách mezi plicními alveoly – emfyzém plic

upravit Ateroskleróza

• volné radikály oxidují lipoproteiny LDL – ty jsou dychtivě vychytávány makrofágy v cévní stěně – základ ateromatozního patologického děje

upravit Další

• Revmatické onemocnění, poruchy IS, stavy demence při Alzheimerově chorobě
• Faktor stárnutí

upravit Odkazy

upravit Související články

• Oxidačný stres
• Vyšetření parametrů antioxidační kapacity

upravit Použitá literatura

• LEDVINA, Miroslav, et al. Biochemie pro studující medicíny. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2004. ISBN 80-246-0851-0.