Zhotovení histologického preparátu

Pro zkoumání mikroskopických struktur tkání je potřeba zhotovit histologické preparáty. Je nutno tyto preparáty zafixovat, nakrájet a obarvit. Teprve poté je možné vzorky zkoumat.

Obsah 1 Fixace 2 Zalévání tkání 3 Krájení řezů 4 Barvení řezů 5 Montování řezů 6 Odkazy 6.1 Použitá literatura

upravit Fixace

Po odebrání vzorku tkáně se musí rychle po odejmutí z těla fixovat, tedy konzervovat proti autolýze. Ošetření vzorku proti působení vlastních enzymů spočívá v ponoření tkáně do stabilizačního (fixačního) činidla neboli fixativu.

Fixace by měla probíhat tak, aby se předešlo znehodnocení vzorku; používají se proto vhodné denaturační prostředky. Pro úspěšnou fixaci existují tři hlavní požadavky – má být šetrná, rychle pronikat vzorkem a umožnit jeho další zpracování. Fixační činidla mají své výhody a nevýhody. Některá činidla šetrně denaturují proteiny, jiná naopak způsobují jejich shlukování. Proto byly vyvinuty fixační směsi, které mají co nejvýhodnější vlastnosti.

• Bouinův roztok – jedna z nejčastěji používaných fixačních směsí; obsahuje kyselinu pikrovou, formol, kyselinu octovou a vodu.

• Zenkerova tekutina – obsahuje formol, dvojchroman draselný, sublimát a vodu.

Dalším často používaným fixačním činidlem je formol (40% vodný roztok formaldehydu) v 10% koncentraci.

Pro využití elektronového mikroskopu se používá osmium tetroxid díky jeho šetrným vlastnostem.

Možnosti fixace jsou nejen chemické, ale i fyzikální – např. rychlé zmražení tkáně, které inaktivuje enzymy. Při takovém postupu je nutné pracovat i nadále se zmraženým vzorkem.

upravit Zalévání tkání

Fixované vzorky je nutno nakrájet na tenké řezy; aby bylo možno tkáň na mikrotomu nakrájet, musí být zakomponována do zalévacího média.

Nejběžnějším, i když ne jediným zalévacím médiem je parafin. Nehodí se pro tvrdé tkáně, např. pro zuby. Při zalévání pro účely elektronové mikroskopie se tkáně prosycují umělými pryskyřicemi.

Před samotným zaléváním se vzorky obvykle odvodňují a projasňují. Odstranění vody se provádí alkoholovými lázněmi vzestupné koncentrace. Začíná se obvykle od 70% a končí se 100%. Poté se lázně nahradí rozpustidlem, které se mísí se zalévacím médiem (pro zalévání do parafinu se používá xylol). To už je fáze projasňovaní – po prosycení rozpustidlem tkáň zprůsvitní.

Projasněná tkáň se dále přenese do parafinu roztaveného při 58–60°C – hraniční teplota, kdy je parafin ještě tekutý a tkáň není poškozena. Rozpustidlo se z tkáně odpaří a je nahrazeno parafinem.

upravit Krájení řezů

Aby bylo možno vzorky správně zkoumat pod mikroskopem, je důležité je nakrájet na velmi tenké řezy. Tkáně se krájí na tzv. mikrotomech; vzorky určené pro elektronovou mikroskopii jsou krájeny na ultramikrotomech.

Řezy se krájí na nastavitelnou tloušťku – 1–10 µm (v ideálním případě mají kolem 5 µm). Ultramikrotomy krájí mnohem tenčí řezy – mají kolem 0,02–0,1 µm.

Řezy se poté přenesou na teplou vodní hladinu, kde se tzv. napnou a poté na podložní sklíčko. Sklíčka s řezy se dají do termostatu, aby se zbavila vody.

upravit Barvení řezů

Většina histologických struktur je bezbarvá. Aby bylo možno rozpoznávat jednotlivé tkáňové útvary, preparáty se barví.

Připravené řezy jsou prosyceny parafinem, který je s vodou nemísitelný. Používaná barviva se obvykle rozpouští ve vodě nebo v alkoholu, a proto je nutné tkáň zbavit parafinu. Tzv. deparafinace se provádí v xylenu, po kterém následuje sestupná řada alkoholů (tzv. zavodnění) se sestupnými koncentracemi (96%, 80%, 70%). Po této proceduře je vzorek tkáně připravený k barvení.

Většina histologických barviv se chová jako kyselé nebo zásadité látky. Podle chemické afinity dělíme struktury na basofilní a acidofilní. Basofilní struktury se barví bazickými barvivy - např. hematoxylinem. Typicky se jedná např. o jádro s DNA. Acidofilní struktury (ve své podstatě jsou zásadami) se barví kyselými barvivy - např. eosinem - proto se někdy užívá také termín eosinofilní. Typicky acidofilní je cytoplazma.

Nejčastěji používaná barvicí směs je

• hematoxylin a eosin – hematoxylin barví modro-fialově, eosin růžovo-červeně. Jedná se o přehledné barvení.

Dále se používají speciální barvení, např.:

• Trichromy – žlutý, modrý a zelený, odliší kolagenní vazivo a sval
• Alciánová modř - zvýrazní gylkosaminoglykany
• Impregnace stříbrem - barvení retikulárních vláken, neuronů a axonů, glie.

upravit Montování řezů

Poslední fází přípravy histologického preparátu je přilepení krycího sklíčka na obarvený řez. Před přilepením sklíčka se na tento řez kápne montovací médium, dříve často kanadský balzám, dnes akrylátová media. V případě, kdy nelze preparát montovat médiem s organickým rozpouštědlem, využívají se montovací média na vodné bázi.

Preparáty určené k elektronové mikroskopii se volně pokládají na kovové síťky (elektrony nemohou pronikat sklem).

upravit Odkazy

upravit Použitá literatura

• JUNQUIERA, L. Carlos, José CARNEIRO a Robert O. KELLEY. Základy histologie. 7. v ČR 1. vydání. Jinočany : H & H 1997, 1997. ISBN 80-85787-37-7.