Zpracování vzorků pro histologické vyšetření

Obsah 1 Fixace vzorku 1.1 Fyzikální metody fixace 1.2 Chemické metody fixace 1.2.1 Formol (formalín) 1.2.2 Bakerova tekutina 1.2.3 Bouinova tekutina 1.2.4 Bromformol 1.3 Fyzikálně-chemické metody fixace 2 Odkazy 2.1 Související články 2.2 Reference 2.3 Použitá literatura

upravit Fixace vzorku

Po odebrání vzorku tkáně dojde k přerušení regulačních vztahů buněk, zásobování kyslíkem, dezorganizaci buněčného metabolismu a činností vlastních enzymů buňky dochází k autolýze (posmrtnému samonatrávení) buněk. Vzorek může být znehodnocen i mikroorganismy (hniloba − v laboratoři by k ní nemělo nikdy dojít). Těmto změnám zabráníme rychlou fixací vzorku (okamžitě po odběru).

Fixace = denaturace bílkovin (tedy i enzymů) buněk a tkání prováděná za tím účelem, aby nedošlo k autolýze.

upravit Fyzikální metody fixace

Činnost enzymů je vázána na vodné prostředí, proto ustane, když ovlivníme transportní funkci vody.

1. Působení velmi nízkých teplot:
   • metoda freezing-drying (vysoušení za mrazu) − rychlá sublimace vody, která nastává ve vakuu; velmi drahá metoda;
   • metoda velmi rychlého zmrazení − pomocí tzv. suchého ledu nebo kapalných plynů např. dusíku; rychlost je důležitá, aby nevznikly krystaly ledu, které poničí buňky.
2. Působení vysokých teplot:
   • používá se v mikrobiologii − nátěr bakterií na podložním skle se protáhne plamenem kahanu;
   • v poslední době se využívá také mikrovlnné záření − řízený ohřev v mikrovlnné troubě v rozmezí 45 − 55 °C ^[1] jemně denaturuje bílkoviny vzorku (použití v běžných histopatologických metodách, ale i pro rychlé zpracování peroperační biopsie).

upravit Chemické metody fixace

• Rychlá a šetrná denaturace bílkovin pomocí chemických fixačních prostředků.
• Princip: aldehydové fixační prostředky působí tak, že vytváří můstky mezi bílkovinnými řetězci → zesíťovatění bílkovin → v důsledku toho jsou vazebná místa na molekulách enzymů nepřístupná (to ale vadí při imunohistochemických průkazech − zde se používají metody pro tzv. antigen retrieval, kdy se vazebné místo znovu zpřístupní).
• Používají se roztoky několika látek − tzv. fixační roztoky (fixační tekutiny).
• Obvykle se fixuje při pokojové teplotě (či mírné zahřátí − usnadní průnik roztoku do vzorku).
• Vzorek necháme ve fixační tekutině po přesně danou dobu (u fixace formolem je běžná doba fixace 24 hod., ale vzorek neutrpí ani při delší fixaci, oproti tomu při fixaci v tekutině se sublimátem je nutné dodržet přesnou dobu fixace, protože při delší fixaci vznikají fixační artefakty).
• Zvláštní postupy platí pro elektronovou mikroskopii, kde se používají vzorky o velmi malých rozměrech, proto i fixační časy jsou kratší.

Požadavky na fixační tekutinu:

1. Fixuje rychle, ale šetrně (nepoškozuje, zachovává strukturu buněk a tkání).
2. Musí pronikat rychle do tkáně, působit v celém vzorku (když nepronikne celým vzorkem → problém).
3. Umožňuje další zpracování vzorku.

• Optimální vzorek má velikost do 1 cm³. Tekutiny musíme dát 25−50 krát více než je objem vzorku.
• Vzorek v nádobě s fixační tekutinou podložíme filtračním papírem/gázou (jinak by došlo k přilepení vzorku na dno nádoby a zespoda by se nefixoval).

upravit Formol (formalín)

• Nejčastěji používaná fixační tekutina.
• Formol je triviální název pro roztok formaldehydu.
• 40% roztok formaldehydu ve vodě (je to nasycený roztok) je označován jako 100% formol.
• Skladován v lahvích z tmavého skla s vrstvou mletého CaCO₃ (MgCO₃). Na světle vzniká oxidací formaldehydu kyselina mravenčí (změna pH → poškození tkáně). Tmavé sklo brání oxidaci a mletý vápenec váže vzniklou kyselinu mravenčí (vzniká nerozpustný mravenčan vápenatý).
• Před použitím se 100% formol ředí na roztok o koncentraci 10−25 % (odpovídá 4−10% roztoku formaldehydu). Formol ředíme NE destilovanou, ale zásadně pramenitou vodou (používá se z vodovodu), protože ta přináší látky, které udržují formol v neutrálním stavu. Kromě pramenité vody se k ředění někdy používá fyziologický roztok („slaný formol“) nebo pufr („nárazníkový formol“).
• Fixace trvá 24 hodin (nepřefixovává → vzorek v něm může zůstat i déle).

upravit Bakerova tekutina

• Formol + CaCl₂
• Vhodná pro fixaci lipidů.
• Fixace 24 hodin.

upravit Bouinova tekutina

• Tekutina žluté barvy.
• Nasycený roztok kys. pikrové (3 díly) + formol (1 díl) + před použitím přidat na každých 100 ml roztoku 5 ml ledové kyseliny octové.

upravit Bromformol

upravit Fyzikálně-chemické metody fixace

• Kombinace fyzikálních a chemických metod − např. silně vychlazená fixační tekutina.

upravit Odkazy

upravit Související články

• Odběr materiálu pro histologické vyšetření
• Biopsie

upravit Reference

1. ↑ JIRKOVSKÁ, Marie. Histologická technika. 1. vydání. Praha : Galén, 2006. 80 s. ISBN 80-7262-263-3.

upravit Použitá literatura

• JIRKOVSKÁ, Marie. Histologická technika. 1. vydání. Praha : Galén, 2006. 80 s. ISBN 80-7262-263-3.

• Brichová, Hana: Zpracování materiálu pro histologické vyšetření. [Praktikum pro 1. ročník 1. LF UK (obecná histologie, všeobecné lékařství)]. Praha, 2008.