Aminotransferázy

Z WikiSkript

Aminotransferázy jsou enzymy, katalyzující transaminaci, jejíž podstatou je přenos aminoskupiny z aminokyseliny na ketokyselinu a naopak. Z klinicko-biochemického hlediska jsou nejdůležitější alaninaminotransferáza a aspartátaminotransferáza.

Alaninaminotransferáza

Pencil.png upravit Alaninaminotransferáza (ALT, EC 2.6.1.2) katalyzuje transaminační reakci, při níž se reverzibilně přenáší aminoskupina z alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a glutamátu. Kofaktorem je pyridoxal-5´-fosfát.

ALT je obsažena nejvíce v játrech, v jiných orgánech (kosterní sval, myokard a další) je její aktivita mnohem nižší. Na rozdíl od AST je lokalizována pouze v cytoplazmě.

Stanovení ALT je citlivým a relativně specifickým testem pro poškození hepatocytu. Její aktivita v séru se zvyšuje již při malém poškození jaterní buňky, které je způsobeno zvýšenou propustností cytoplazmatické membrány. U zánětu jater (např. virová hepatitida) je zvýšení ALT nejčasnějším indikátorem porušení celistvosti membrány hepatocytu. Sledování ALT je vhodné pro monitorování průběhu onemocnění.

Fyziologické hodnoty S-ALT
muži do 0,80 μkat/l
ženy do 0,60 μkat/l

Aspartátaminotransferáza

Pencil.png upravit Aspartátaminotransferáza (AST, EC 2.6.1.1, anglicky SGOT (serum glutamic-oxaloacetic transaminase) katalyzuje reverzibilní přenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát. Kofaktorem reakce je podobně jako u ALT pyridoxal-5´-fosfát.

AST se ve větší míře vyskytuje v řadě orgánů – v játrech, myokardu, kosterním svalstvu, ledvinách, pankreatu a v erytrocytech. Existuje ve formě dvou izoenzymů – mitochondriálního, který je přítomen v mitochondriích a představuje asi 70 %, a cytoplazmatického, lokalizovaného v cytoplazmě, který je zastoupen asi z 30 %. Cytoplazmatická frakce se uvolňuje do cirkulace snadno i při mírném poškození hepatocytů, a to při narušení permeability jejich buněčné membrány. Mitochondriální frakce se dostává do krve až při nekróze (rozpadu) jaterní buňky. Výrazné zvýšení aktivity AST v séru je proto známkou rozpadu hepatocytů, neboť do cirkulace se uvolňují oba izoenzymy.

Protože AST není specifická pouze pro jaterní tkáň, její zvýšení může doprovázet i poškození kosterního svalstva a myokardu. AST stoupá v krvi u akutního infarktu myokardu a po operacích srdce, ale i po dlouhotrvající fyzické námaze. Stanovení AST falešně pozitivně ovlivňuje hemolýza, neboť v erytrocytech je obsažena v poměrně vysokém množství.


Fyziologické hodnoty S-AST
muži do 0,85 μkat/l
ženy do 0,60 μkat/l

Klinicko-biochemické využití

Aminotransferázy se významně uplatňují v klinicko-biochemické diagnostice jaterních onemocnění.

Pro akutní virovou hepatitidu je charakteristické mnohonásobné zvýšení katalytické koncentrace AST a ALT. Vzestup na 2–3 násobné hodnoty je zaznamenáván již v prodromálním stádiu, vrcholí 7.–12. den po nástupu ikteru (maximum až 100 μkat/l). Normalizace hladin je zaznamenávána obvykle 5.–8. týden. Výrazně (řádově desetinásobně), ale jen krátkodobě bývají transaminázy zvýšené při těžkých biliárních kolikách. Ostatní jaterní léze jsou zpravidla doprovázeny mírnějším, maximálně pětinásobným vzestupem aktivity a při chronických onemocněních jater bývají aktivity transamináz často jen těsně nad horní hranicí referenčního rozmezí.

Obecně se dá říci, že míra vzestupu transamináz dobře odráží rozsah jaterního poškození. Je však třeba mít na paměti, že při úbytku funkční jaterní tkáně, např. při cirhóze jater, se může množství buněk, ze kterých se mohou transaminázy uvolnit, snížit natolik, že sérové aktivity transamináz spadají do referenčního rozmezí nebo jen těsně nad něj i při rozsáhlé jaterní lézi.

S mírným nespecifickým vzestupem obou transamináz se můžeme setkat i po intenzivní fyzické námaze (dochází k jejich uvolnění z kosterního svalstva) a také u obézních osob.

Metody stanovení ALT a AST

Pro stanovení koncentrace katalytické aktivity AST a ALT je doporučena metoda založená na principu Warburgova optického testu.

Aspartátaminotransferáza

Pencil.png upravit Stanovení aktivity AST využívá dvoustupňové reakce.

Stanovení katalytické koncentrace AST.MD – malátdehydrogenáza
  • V první enzymové reakci, katalyzované AST, která je přítomna ve vyšetřovaném vzorku, se tvoří oxalacetát.
  • Vzniklý oxalacetát je v další indikační reakci účinkem enzymu malátdehydrogenázy (MD) redukován na malát za současné oxidace NADH na NAD+. Aktivitu AST stanovíme kineticky na základě rychlosti úbytku NADH v průběhu reakce měřením absorbance při 334, 340 nebo 365 nm. Katalytická koncentrace AST je úměrná poklesu absorbance.
  • V reakční směsi pro stanovení AST je kromě substrátu (L-aspartát a 2-oxoglutarát), malátdehydrogenázy a NADH přítomen pyridoxal-5´-fosfát a laktátdehydrogenáza. Přídavek pyridoxal-5´-fosfátu zabezpečuje dostatečnou saturaci AST a tím zajišťuje plnou aktivitu enzymu. Přítomnost laktátdehydrogenázy je nezbytná k tomu, aby se zajistila redukce endogenního pyruvátu (přítomného ve vzorku), která rovněž spotřebovává NADH, a tím se zabránilo získání falešně vyšších výsledků. Tyto reakce probíhají během 5–15 minutové preinkubace séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu.
  • Po preinkubaci startujeme reakci katalyzovanou AST přidáním 2-oxoglutarátu. Po krátké lag fázi je monitorována ΔA odečítáním absorbance v minutových intervalech po dobu několika minut nebo kontinuálním sledováním. Protože počáteční absorbance reakční směsi má vyšší hodnotu, doporučuje se provádět odečet proti slepé zkoušce, kterou může být např. roztok dvojchromanu draselného.
Alaninaminotransferáza

Pencil.png upravit Stanovení ALT je podobně jako stanovení AST založeno na dvoustupňové reakci. Princip je stejný jako u AST, pouze jako donor aminoskupiny slouží místo aspartátu alanin a jako enzym pro indikační reakci je použita laktátdehydrogenáza (LD), která zároveň plní funkci enzymu zabezpečujícího redukci endogenních oxokyselin.

Stanovení katalytické koncentrace ALT. LD – laktátdehydrogenáza
Postup
  • V první enzymové reakci, katalyzované alaninaminotransferázou přítomnou ve vzorku, vzniká z alaninu pyruvát.
  • Vznikající pyruvát je redukován na laktát v indikační reakci katalyzované laktátdehydrogenázou přidanou společně s NADH do reakční směsi. Redukce pyruvátu na laktát je doprovázena úbytkem NADH, který se projeví poklesem absorbance při 334, 340 nebo 365 nm. Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance.
  • Podobně jako v případě AST vyžaduje pracovní postup 5–15 minutovou preinkubaci séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu. Reakce je startována 2-oxoglutarátem.


Odkazy

Související články