Biochemie genového inženýrství

Z WikiSkript

Genové inženýrství je vědní obor zabývající se umělými rekombinacemi syntetických a přirozených nukleových kyselin in vitro se záměrem vytvořit nové biologické systémy prospěšné člověku.

Základní metody byly vyvinuty díky převratným objevům v enzymologii nukleových kyselin. Těmito metodami lze změnit genovou výbavu organismu nebo upravit uspořádání genomu. Úpravy DNA se provádí mnoha metodami, připomeňme si jen ty nejdůležitější.

Štěpení DNA

Pencil.png upravit Definované štěpení DNA bylo umožněno objevem restrikčních endonukleáz (restriktáz). Tyto enzymy štěpí dsDNA na zcela určité centrálně symetrické sekvence nukleotidů zvané palindrom (viz tabulka). Restriktázy jsou přirozené enzymy bakterií, kde jsou součástí tzv. restrikčně-modifikačního systému. Tatáž sekvence je ve vlastní DNA tímto systémem methylována, což restriktázám brání v degradaci vlastní DNA. Systém je tedy mířen k degradaci cizorodé DNA, která dotyčné cílové sekvence nemá chráněny. Vnikne-li fágová DNA do baktérie, je v převážné míře degradována – fág podlehne restrikci. Jen výjimečně je některá z fágových DNA systémem methylována, fág přežije, byl modifikován a může se v daném bakteriálním kmenu množit.

Cílové sekvence DNA restriktáz
enzym původ cílová sekvence
EcoRI Escherichia coli G↓AATTC

CTTAA↑G

HindIII Haemophilus influenzae A↓AGCTT

TTCGA↑A

BsuI Bacilus subtilis GG↓CC

CC↑GG

Specifita restriktáz byla využita v enzymologii DNA. Bylo popsáno kolem stovky takových enzymů, nazývají se zkratkami názvů bakterie, v níž byly objeveny (EcoRI – E. coli, Haelll – Haemophilus influenzae). Každá restriktáza má specifickou cílovou sekvenci, v níž štěpí buď protější fosfodiesterové vazby dsDNA nebo vazby symetricky vzdálené několik nukleotidů od centra symetrie (viz tabulka). Ve druhém případě se tvoří kohezní („lepivé“) konce vzniklých restrikčních fragmentů, které se mohou reasociovat, a to i s fragmenty získanými štěpením jiné DNA stejnou restriktázou. Tato možnost je velice výhodná při rekombinaci fragmentů a konstrukci nových genů a genomů. Dnes ovšem není problémem uměle vytvořit jakékoli kohezní konce u kteréhokoli fragmentu dsDNA.

Dalším biotechnologicky významným enzymem je DNA-ligáza, objevená při studiu přirozené replikace DNA. Kovalentně spojuje 3'-OH konec řetězce s 5'-P koncem DNA.

Elektroforéza nukleových kyselin

Pencil.png upravit Úseky DNA, produkty PCR reakce nebo štěpy DNA můžeme v zásadě dělit chromatograficky nebo elektroforézou. Elektroforetické dělení je mnohem používanější. Provádí se zpravidla v gelu, a to buď agarosovém, nebo polyakrylamidovém. V obou případech se molekuly, které v zásaditém prostředí nesou záporný náboj, pohybují v elektrickém poli od katody k anodě. Gely tvoří poměrně hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly – mluvíme proto o technice molekulového síta.

Elektroforéza v agarosovém gelu

Agarosa

Agarosa je polysacharid tvořený D-galaktosou a anhydro-L-galaktosou, který produkují některé mořské řasy a pod názvem agar se používá k výrobě gelů v potravinářství, mikrobiologii, imunologii či biochemii. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarosy. Čím je obsah polysacharidu vyšší, tím je lepší rozlišovací schopnost gelu, ale tím je také průběh elektroforézy pomalejší a příprava gelu je technicky náročnější.


Volba koncentrace agarosového gelu pro elektroforézu DNA
Obsah agarosy v gelu Délka DNA
0,5 % 1–30 kbp
0,7 % 0,8–12 kbp
1,0 % 0,5–10 kbp
1,2 % 0,4–7 kbp
1,5 % 0,2–3 kbp
2,0 % 50 bp–2 kbp
3–4 % 10 bp–1 kbp


Do agarosového gelu se většinou přímo přidává ethidiumbromid, takže po skončení elektroforézy lze jednotlivé frakce zobrazit UV zářením. Jinou možností detekce je blotting na membránu a následné obarvení nukleových kyselin nebo hybridizace se značenými sondami.


Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu

Polyakrylamid

Jiným nosičem používaným při elektroforéze nukleových kyselin je polyakrylamidový gel. Polymerací akrylamidu vznikají lineární molekuly polyakrylamidu. Ty se spojují příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘-methylenbisakrylamidem. Akrylamid i methylenbisakrylamid jsou poměrně stabilní látky; polymerace probíhá v nepřítomnosti vzdušného kyslíku (odstraní se odvzdušněním pomocí vakua) a zahajuje se přimíšením katalyzátorů peroxydisíranu amonného (známého pod starším názvem persíran amonný, krátce APS) a N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminu (TEMED).

TEMED

APS ve vodném roztoku s TEMED uvolňuje volné kyslíkové radikály, které atakují molekuly akrylamidu a bisakrylamidu a spouštějí tak jejich polymeraci.

Molekulové síto polyakrylamidového gelu je poměrně husté, hodí se proto pro rozdělování kratších fragmentů.

Volba koncentrace polyakrylamidového gelu pro dělení DNA
Polyakrylamid Délka DNA
3,5 % 1–2 kbp
5 % 75–500 bp
8 % 50–400 bp
12 % 35–250 bp
15 % 20–150 bp
20 % 5–100 bp


Díky tomu, že polyakrylamid je méně reaktivní než agarosa, lze fragmenty DNA kromě metod používaných v agarosovém gelu obarvit i dalšími technikami. Z klasických metod patří mezi nejcitlivější stříbření, kterým lze detekovat množství DNA i o několik řádů nižší než ethidiumbromidem.

Hybridizace

Často se využívá k identifikaci hledaného řetězce, nebo jeho části. Hledaná sekvence nukleotidů hybridizuje s předem připravenou a označenou sondou (řetězec DNA nebo RNA, označený fluorochromem nebo detekovatelným radioizotopem).

Hybridizace je děj, při kterém se spojují dva komplementární řetězce, je možné kombinovat DNA i RNA. zjednodušeně ji lze rozdělit na:

  1. denaturaci vzorku – rozpad vodíkových můstků mezi bazemi a oddělení řetězců (zahřátí),
  2. přidání sondy – řetězec nukleové kyseliny, jehož komplementární část hledáme,
  3. renaturace – pomalou renaturací (ochlazováním), při které se spojují komplementární řetězce,
  4. vyhodnocení experimentu, vyšetření.

Syntéza umělé DNA

Pencil.png upravit

Vzorec fosfoamiditu (5'-OH je blokována tritylem) a jeho navázání na rostoucí polynukleotid, fixovaný na nosič v koloně.

Potřebný řetězec DNA lze připravit různým způsobem. Jsou již k dispozici dokonce automatizované postupy, jak syntetizovat DNA o žádané sekvenci z jednotlivých nukleotidů.

Základním principem je potlačit na nukleotidech reaktivitu 3'-OH, 5'-OH a případně i -NH2 skupin, senzitivních na kondenzující agens. Jejich ochrany se docílí navázáním vhodných organických skupin, např. tritylové, benzoylové, acetylové apod. Tyto skupiny je možné snadno odstranit např. změnou pH, čímž se reaktivní skupina nukleotidu odkryje pro bezprostřední reakci.

Protekce reaktivních skupin při syntéze umělého oligonukleolidu

Typickým příkladem je toto uspořádání: na kolonu se skleněným nosičem (drobné částice) je navázán první nukleotid, na němž jsou popsaným způsobem chráněny všechny skupiny kromě 5'-OH. Kolona je pak promývána roztokem dalšího, aklivovaného nukleotidu. Bývá to deoxyribonukleosid 3'-fosfoamidit, který se naváže na 5'-OH fixovaného nukleotidu. Po oxidaci trojmocného fosforu na pětimocný vzniká fosfodiesterová vazba a dinukleolid.

Odstraní se protekce na jeho 5'-konci a kolona se promývá dalším aktivovaným nukleotidem atd. Vhodnými podmínkami se pak odstraní všechny protektivní skupiny a methyly z fosfátů, a uvolní se z kolony hotový oligonukleotid.

Popis postupu je značně zjednodušen, syntéza oligonukleotidu trvá hodiny. Rychlost procesu nesnese srovnání s rychlostí přirozené biosyntézy (např. v E. coli 16 000 bazí za minutu). Nicméně možnost vytvořit DNA o jakékoli primární struktuře je nesmírným pokrokem. Syntetické fragmenty DNA lze enzymově spojovat v delší řetězce umělé DNA.

Pomnožení a exprese genu

Zjednodušeně tento postup vyžaduje:

  • konstrukci vektoru – nosič nového genu, schopný vniknout do hostitelské buňky,
  • selekce hostitelské buňky- odlišit buňky se změněným genotypem,
  • pomnožení vybraných hostitelských buněk,
  • vytvoření podmínek pro efektivní resp. ekonomicky výhodnou expresi nového genu v hostitelské buňce.

V současné době jsou všechny tyto postupy do značné míry zvládnuty a využívány ke studiu lidského, živočišného i rostlinného genomu, k diagnostice molekulárních chorob (dědičných chorob) a k jejich terapii a k výrobě nových látek včetně léků, a též ke šlechtění hospodářských rostlin. Mnohé z těchto použití jsou řazeny do moderního průmyslového odvětví zvaného biotechnologie.


Odkazy

Související články

Zdroj

  • ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Praha : Medprint, 1998. ISBN 80-902036-2-0.


Použitá literatura

  • ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Praha : Medprint, 1998. ISBN 80-902036-2-0.
  • NEČAS, Oldřich. Obecná bioogie pro lékařské fakulty. 3. vydání. Jinočany : H+H, 2000. ISBN 80-86022-46-3.