Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Z WikiSkript
Symbol kept vote.svg

Mezi nejstarší a doposud nejrozšířenější techniky používané v DNA diagnostice patří bezesporu restrikční analýza (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Využívá bakteriálních endonukleas (restriktas), které dokáží štěpit DNA, pokud obsahuje určitou přesně definovanou sekvenci nukleotidů. Bakterie se pomocí těchto enzymů brání před infekcí viry: virová DNA může být snadno rozštěpena, na rozdíl od vlastní nukleové kyseliny, která je před degradací chráněna methylací.

Úsek DNA, který bude endonukleasou rozpoznán a štěpen, je dlouhý zpravidla jen několik párů bazí a často jde o palindromatickou sekvenci. Díky tomu může vytvořit smyčku, kterou enzym snáze najde a odstřihne. Pokud jedna alela určitého genu obsahuje rozpoznávací sekvenci, zatímco jiná nikoliv, bude DNA první alely rozštěpena, zatímco DNA druhé alely zůstane vcelku. Při elektroforéze fragmentů pak pro rozštěpenou sekvenci nalezneme dva kratší úseky, kdežto nerozštěpená DNA vytvoří v gelu jen jeden proužek odpovídající delší sekvenci o původní délce.

Příkladem může být endonukleáza KpnI. Jejím zdrojem je bakterie Klebsiella pneumoniae OK8. Sekvence, kterou tato endonukleáza dokáže rozpoznat, je GGTACC (všimněte si, že jde o palindrom), přičemž oba řetězce dvoušroubovice přeruší mezi cytosiny (tj. dvoušroubovice DNA bude mít po rozštěpení „nerovný konec“):

Endonukleáza nenaštěpila ani jednu alelu u A, zatímco u B naštěpena jedna alela. Na elektroforéze se restrikční segmenty objeví jako dvě nové linie.

KPnI.jpg

V tabulkách restrikčních enzymů bude obvykle charakterizována zápisem GGTAC^C.

Jednotlivé endonukleasy se liší podmínkami, za nichž optimálně pracují. Mnoho z nich pracuje při vyšších teplotách, v roztocích s vyšším obsahem solí apod. Např. TaiI je endonukleasa izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus Cc1-331. Její rozpoznávací sekvence je ACGT^ (opět jde o palindrom). Ke své práci vyžaduje teplotu kolem 65 °C a pufr s vyšší iontovou sílou.

Externí odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]