Posttranslační úpravy a targeting proteinů

Z WikiSkript

Jak u baktérií tak u eukaryot jsou některé proteiny určeny pro cytosol, jiné jsou součástí membrán a nebo jsou sekretovány mimo buňku. V eukaryotických buňkách jsou některé proteiny po dokončení jejich syntézy poslány do buněčných organel, např. do lysosomů, mitochondrií buněčného jádra a u rostlin do chloroplastů. Odeslání nových proteinů k místu jejich určení se nazývá targeting (angl. target = místo určení, cíl).

Signální sekvence polypeptidu, volné a vázané ribozómy

Pencil.png upravit

Cytosolové proteiny jsou syntezovány na volných cytosolových ribosomech, zatímco membránové bílkoviny, proteiny organel a bílkoviny uvolňované mimo buňku se syntezují na ribosomech vázaných na hrubé endoplazmatické retikulum (ER). Volné a vázané ribosomy jsou strukturně a funkčně zcela stejné, o jejich vazbě na ER rozhoduje sekvence syntezovaného řetězce. Většina proteinů určených mimo cytosol má na N-konci tzv. signální sekvenci o 13 - 16 aminokyselinách. I když se tyto sekvence od proteinu k proteinu liší, zastoupení několika hydrofobních aminokyselinových zbytků je zde charakteristické. Sekvence je rozpoznávána částicí SRP (signal recognition particle), skládající se ze šesti proteinových podjednotek a 7SL RNA. Naváže se na signální sekvenci syntezovaného proteinu a zastaví translaci v počáteční fázi. Membrána ER obsahuje receptory pro SRP. Jakmile se na ně komplex ribosom-SRP naváže, pak za účasti dalších dvou membránových proteinů, riboforinu I a II, pokračuje proteosyntéza a současně petidový řetězec prochází membránou do cisterny ER. SRP se opět z receptoru uvolní do cytosolu.

Signální sekvence je pro translokaci rozhodující. Je-li genovou manipulací připojena k cytosolovému proteinu, např. hemoglobinu, pak je tato bílkovina uvolňována mimo buňku. Translokace peptidu je aktivní membránový proces, vyžadující energii (ATP). Prostup není poháněn translací, ribosomem. Teoreticky by mohl probíhat i po dokončení syntézy řetězce na volném ribosomu. Včasná vazba syntezovaného proteinu a ribosomu na ER je však výhodná a většinou potřebná, neboť po syntéze na

volném ribosomu by protein mohl zaujmout konformaci, která by translokaci přes membránu znemožnila.
Signální peptidáza
Těsný prostor mezi místem translace a translokace nedovolí, aby se řetězec konformoval dříve než na druhé straně membrány nebo v ní. Některé proteiny zůstanou zakotveny v membráně, což je dáno též jejich primární sekvencí.

Membránové proteiny totiž kromě signální sekvence mají ještě zakotvující, stop-transferasovou sekvenci, která translokaci přes membránu ukončí a protein zůstane zakotvenou součástí membrány. Signální sekvence těchto proteinů může být i poněkud vzdálená od N-konce. Některé mají takových sekvencí dokonce několik, střídají se se stop-transferovými úseky, takže jsou v membráně zakotveny několikerým způsobem, někdy i několikanásobně (viz obrázek). Signální sekvence sekretovaných proteinů bývá ještě v průběhu translokace odštěpena membránovou signalasou. Protein proniká do cisterny ER. Zde a zejména pak v Golgiho aparátu, je kovaletně modifikován (viz Posttranslační glykosylace proteinů) a potom dopraven na místo své funkce.

Posttranslační glykosylace proteinů

Pencil.png upravit Po translokaci do cisteren ER se mnohé proteiny dále upravují. Odštěpí se signální peptid, vytváří se disulfidové vazby. Později se může proteolyticky z polypeptidového řetězce vyštěpit určitý úsek, a tím se protein funkčně aktivuje (hormon, enzym). Funkce řady proteinů může být modifikována fosforylací, acetylací nebo ADP-ribosylací (str.OOO). Mnoho proteinů získá v ER a v Golgiho aparátu oligosacharidové zbytky, takže se z nich stanou glykoproteiny. Uvedené změny hotového peptidového řetězce se nazývají posttranslační úpravy proteinů, nebo též jejich kovalentní modifikace. Toto strukturní a funkční zrání proteinu je velmi významné pro regulaci biochemických pochodů.

Vzorec dolicholfosfátu (n = 15 až 19)

Oligosacharidy se vážou buď N-glykosidovou vazbou na asparaginový zbytek nebo O-glykosidovou vazbou na serinový nebo threoninový zbytek proteinu. Prekurzory oligosacharidů se syntezují na isoprenovém nosiči – dolicholfosfátu, obsaženém v membráně ER. Pokud je jeho fosfátová skupina na cytosolové straně membrány, navazují se na ni postupně dva N-acetylglukózaminy a pět mannos. Dolicholfosfát s tímto heptasacharidem je pak v membráně orientován tak, že oligosacharid je na luminární straně membrány, směřuje do cisterny ER. Zde se na něj z jiného dolicholfosfálového prekurzoru přenesou další čtyři mannosy a tři glukózy (viz obrázek).

Takto aktivovaný oligosacharid se přenese na Asn peptidu, fosfatasa odštěpí jeden z fosfátů dolicholpyrofosfátu a regenerovaný dolicholfosfát může opět vstoupit do reakčního cyklu. Zmíněnou fosfatasu blokuje antibiotikum bacitracin. Připojení Glc-NAc na dolicholfosfát je inhibováno antibiotikem tunicamycinem.

Ještě v ER se od N-vázaného oligosacharidu odštěpí tři glukózy a jedna mannosa. Protein je pak přemístěn do Golgiho aparátu (GA). V jeho váčcích se na protein navazují oligosacharidy též O-glykosidovou vazbou. N-vázané oligosacharidy se dále upravují. Postupně je odštěpeno šest mannos a připojeny další GlcNAc, galaktosy, fukosa a nakonec sialová kyselina (kys. N-acetylneuraminová). Tyto úpravy v Golgiho aparátu se nazývají terminální glykosylace na rozdíl od základních glykosylací (core glycosylations) probíhajících již v ER. Oligosacharidy glykoproteinů určených pro lysosomy jsou specificky fosforylovány.

Během všech procesů po přemístění proteinu do cisteren ER jsou peptidy v membránách orientovány tak, že oligosacharidové zbytky jsou na luminální straně membrány (v cisterně, ve váčcích GA, v transportních váčcích). Pokud transportní váčky splynou s plazmatickou membránou, oligosacharidy glykoproteinu se dostanou na zevní, extracelulámí stranu membrány. Zachovává se určitá asymetrie membrán.

Ukázalo se, že oligosacharidy glykoproteinů jsou někdy signálem, jakou si adresou, podle které jsou proteiny z Golgiho aparátu odeslány na správné místo své funkce. Existuje mukolipidosa (I-cell disease), jejíž příčinou je genetická chyba v úpravě oligosacharidových zbytků lysosomálních enzymů. U nemocných je v nich místo mannoso-6-fosfátu pouze mannosa. Následkem této odchylky lysosomální enzymy nejsou přemísťovány do lysosomů, nýbrž ven z buňky a lze je zjistit v krevní plazmě. V lysosomech se naopak hromadí nerozložené glykosaminy a glykolipidy. Pacient trpí psychomotorickou retardací a deformitami kostry.

Glykosylace většiny proteinů však má asi jinou funkci než opatřit molekulu směrovacím signálem. Oligosacharidové zbytky glykoproteinů zvyšují jejich rozpustnost a pomáhají orientovat molekulu proteinu směrem k vodné fázi. Další úlohou oligosacharidů je chránit protein (např. imunoglobulin) před účinkem proteas. Sacharidy jsou markerem pro vychytávání a následnou degradaci plazmatických glykoproteinů v játrech. Další význam je spatřován v tom, že kinetika úprav glykoproteinů v ER a GA udává krok v průchodu těchto proteinů buněčnými organelami, a tím je zajištěn čas potřebný k přesnému třídění syntezovaných proteinů.

Targeting nezávislý na glykosylaci proteinů

Pencil.png upravit Sekreční proteiny a bílkoviny plazmatické membrány nepotřebují ke správné lokalizaci oligosacharidový signál. Předpokládají se jiné typy signalizace (konformarce proteinu, určitý trojrozměrný motiv v jeho struktuře). Tyto proteiny mohou být nějakým způsobem „odeslány“ do apikální nebo bazolaterální části plazmatické membrány, nebo jsou tříděny pro dvojí typ sekrece: konstitutivní sekrece, která je neustálá a rychlá, proteiny se v sekrečních váčcích nezahušťují, nebo řízená sekrece, kdy se proteiny skladují a koncentrují ve vezikulech a uvolní se z buňky až na hormonální popud. Pak teprve váčky splynou s cytoplazmatickou membránou a jejich obsah se uvolní mimo buňku. Příkladem řízené sekrece je uvolňování trávicích enzymů z acinárních buněk pankreatu nebo uvolňování peptidových hormonů z endokrinních buněk.

Targeting mitochondriálních proteinů

Pencil.png upravit Většina mitochondriálních proteinů je syntezována na volných cytosolových ribosomech a postranslač­ně vestavována do mitochondrií. Některé bílkoviny jsou určeny pro zevní, jiné pro vnitřní mitochondriální membránu, další pro intermembránový prostor a pro matrix. O lokalizaci proteinu rozhoduje sekvence N-koncového úseku řetězce, tzv. mitochondriální vstupní sekvence, která je bohatá na bazické amino­kyselinové zbytky a na serin a threonin. Pokud má protein zakotvit v zevní mitochondriální membráně, pak za vstupní sekvencÍ následuje zakotvující sekvence a druhý pozitivně nabitý úsek.

K prostupu proteinu vnitřní mitochondriální membránou je třeba protonový transmembránový gradient. Prostup zevní membránou tento energetický zdroj nevyžaduje. Vstupní sekvence bývá po průchodu vnitřní (nikoli zevní) membránou proteolyticky odštěpena.

Protein přenášený z cytosolu do matrix se nejdříve naváže svou presekvencí na receptor na zevní mitochondriální membráně. V místě prostupu zevní a vnitřní membrána na sebe nalehnou a protein prostupuje oběma najednou. V matrix je přenesený protein odštěpen od membránově zakotvené presekvence.

Intermembránové proteiny (např. cytochrom b) se nejdříve zakotví ve vnitřní mitochondriální membráně a specielní proteasa je pak odštěpí z mezimembránového prostoru. Některé mezimembránové bilkoviny (cytochrom c) zůstanou navázány na vnitřní membránu.

Během průchodu přes membránu se mitochondriální proteiny úplně rozvinou a pak zase obnoví terciární strukturu.

Také bakterie rozesílají syntezované proteiny pomocí signálních sekvencí. Některé jejich proteiny jsou určeny pro plazmatickou membránu, jiné pro zevní membránu, další pro periplazmatický prostor, nebo jsou zřídka uvolňovány mimo buňku. Translokace je poháněna protonovým gradientem. Analogie s mitochondriálním targetingem je tedy zřejmá.

Targeting jaderných proteinů

Pencil.png upravit Jaderné proteiny (histony, polymerasy a j.) jsou syntezovány na volných cytosolových ribosomech. Do jádra pak vstupují póry v jaderné membráně. Tyto póry se otvírají na zvláštní signál, jehož povaha zatím většinou není známa. V případě T-antigenu viru SV40 byla objevena mezi 127 a 131 pozicí sekvence aminokyselin, která je rozhodující pro vstup proteinu do jádra (jaderná lokalizační sekvence). Záměna jediné aminokyseliny tohoto úseku znemožní bílkovině opustit cytosol. Pokud je experimen­tálně tato sekvence vložena do struktury jiného proteinu, objeví se tato bílkovina v jádře i když jaderným proteinem není.

Rozhodovací mechanismus k destrukci nefunkčních proteinů

Pencil.png upravit Také proteiny určené k destrukci a odstranění z buňky podléhají specifickému targetingu. Biologický poločas cytosolových proteinů je velice různý, od několika minut až po více než dvaceti hodin. O délce existence těchto bílkovin rozhoduje jejich N-koncová aminokyselina. Met, Gly, Ala, Ser, Thr a Val je aminokyselina č.1 stabilnějších proteinů (poločas delší než 20 hod). N-koncový Ile nebo Glu signalizují asi půlhodinové přežití peptidu. Pro, Leu, Phe, Asp, Lys a Arg zajistí poločas pouze několika minut. Takový krátký poločas je významný u regulačních peptidů, např. hormonů, aby změny v regulaci byly dostatečně rychlé. Tato signalizace vznikala v časné fázi vývoje života, neboť je známa u baktérií, kvasinek i savců. Mechanismus popsaného targetingu není zcela objasněn. Důležitou úlohu hraje protein ubiquitin (Mr=8500), který je ve všech eukaryotických buňkách. C-koncový Gly ubiquitinu je kovalentně navazován na ε-NH2 lysinu bílkoviny určené k degradaci. Je zajímavé, že ubiqitin je nejdříve aktivován pomocí ATP a tří enzymů a je při tom navazován na jejich skupiny -SH. Tato aktivace tedy připomíná aktivaci mastných kyselin nebo syntézu aa-tRNA (aktivaci aminokyselin), což je jeden z příkladů obecného principu, s jakými se v biochemii setkáme častěji.

Receptorem zprostředkovaná endocytóza

Pencil.png upravit Předchozí kapitoly se zabývaly targetingem vnitrobuněčných proteinů. Princip usměrňování se však uplatňuje též při přijmu proteinů z mimobuněčného prostoru endocytózou, která je zprostředkována interakcí proteinu s membránovým receptorem na povrchu buňky.

Receptor

Zmíněným receptorem je glykoprotein, nacházející se na specielních místech membrány, tzv. potažených jamách (coated pils). Na cytosolové straně těchto míst je plášť z klathrinu. K1athrin díky své trojramenné struktuře je schopen vytvářet síťovitý plášť kolem jamek membrány nebo kolem různých cytoplazmatických vezikulů, vakuol. Po dodání ATP může být klathrinová síť enzyrnově rozrušena a klathrin využit k dalším interakcím.

Po navázání pohlcovaného proteinu na receptor se jamka prohloubí, a klathrin nakonec vytvoří uzavřenou síť, takže se z membrány do cytoplazmy uvolní opláštěný měchýřek (coated vesicle). Ten pak rychle ztratí klathrinový plášť a mění se na endozom neboli receptozom. Obvykle se zvětšuje tím, že splývá s jinými endozomy. Funkce těchto organel spočívá v tom, že se v nich rozhodne, kam má být pohlcený protein dopraven. Důležitým mechanismem při tom je okyselení obsahu endozomu. Stane se tak činností ATP-závislé H+/K+ – pumpy v membráně endosomu.

Pohlcený transferin v kyselejším prostředí uvolní Fe a předá ho do cytosolu na ferritin. Endosom pak splyne s cytoplazmatickou membránou. Komplex receptoru s apotransferinem se objeví na povrchu buňky, v prostředí s vyšším pH, ve kterém se apotransferin uvolní k novému použití.

Proteiny po pohlcení

Jiné proteiny pohlcené receptorem řízenou endocytózou čeká v endozomech jiný osud. LDL-apoprotein, přenášející cholesterol, je po navázání na membránový receptor a po endocytóze předán do lysozomu. Zde je odbourán lyzozomálními proteázami, zatímco receptor je znovu použit na povrchu buňky. Imunokomplexy, inzulín nebo některé růstové faktory jsou v lysozomech odbourány i se svými receptory. To je příklad modulace účinku proteinových hormonů, neboť tímto způsobem se sníží jejich koncentrace v krvi i počet receptorů v cílových buňkách.

V praxi u člověka

Receptorem zprostředkovanou endocytózou jsou transportovány IgG z mateřského mléka střevními enterocyty novorozence. Na opačné straně buňky, sousedící s kapilárou endozom přenášející komplex IgG-receptor splyne s cytoplazmatickou membránou a protilátka se uvolní do krevního oběhu dítěte i s fragmentem receptoru zvaným sekreční složka.

V praxi u virů

Popsaná receptorem zprostředkovaná endocytóza se uplatňuje též při vstupu některých virů do hostitelské buňky. Po fúzi endozomu s lysosomem kyselé prostředí vede ke splynutí virionového obalu s lysozomální membránou, čímž se nukleokapsid s virovou nukleovou kyselinou uvolní do cytosolu.

V konečné fázi virové reprodukce se naopak nově syntezované virové nukleokapsidy uvolní z buňky tím, že z ní vypučí, při čemž se obalí plazmatickou membránou.

  • Také bakteriální toxiny (difterický a cholerový toxin) vstupují do buňky receptorem zprostředkovanou endocytózou.

Odkazy

Související články

Další kapitoly z knihy ŠTÍPEK, S.: Stručná biochemie uchování a exprese genetické informace:
Struktura nukleových kyselin: Základní složky nukleových kyselinPrimární struktura nukleových kyselinŘetězec nukleové kyseliny lze štěpit neenzymovou nebo enzymovou hydrolýzouMetody sekvencováníSekundární a vyšší struktura nukleových kyselin: Sekundární struktura DNADenaturace a reasociace řetězců nukleových kyselin, molekulární hybridizaceSekundární struktura RNATopologie DNA; • Interakce DNA s proteiny, struktura chromosomuBakteriální chromosomEukaryotické chromosomyDNA mitochondrií
Biosyntéza nukleových kyselin: Replikace DNATranskripce
Biosyntéza polypeptidového řetězce – translace: Transferové RNA (tRNA)Aktivace aminokyselin, syntéza aminoacyl-tRNAFunkce ribozómů v translaciTranslace u prokaryotůStruktura ribozómůIniciace translaceElongace peptidůTerminace translaceInhibitory bakteriální translaceTranslace u eukaryotůStruktura ribozómůIniciace eukaryotické translaceElongace eukaryotické translaceTerminace eukaryotické translaceInhibitory eukaryotické translace
Genetický kód
Biosyntéza nukleových kyselin a proteosyntéza v mitochondriích: Replikace mitochondriální DNAMitochondriální transkripceMitochondriální translace
Řízení genové exprese a proteosyntézy: Řízení genové exprese a proteosyntézy u prokaryotRegulace na úrovni transkripceRegulace sigma-faktoryJacobův-Monodův operonový modelRegulační význam cAMP u bakteriíVariace operonového řízení genůTryptofanový a arabinosový operonŘízení terminace transkripceRegulace bakteriální proteosyntézy na úrovni translaceŘízení genové exprese a proteosyntézy u eukaryotRegulace na úrovni uspořádání genůRegulace na úrovni transkripceRegulace posttranskripčních úprav pre-mRNARegulace na úrovni translaceŘízení rychlosti degradace mRNARegulace funkce proteinu kotranslačními a posttranslačními úpravami
Posttranslační úpravy a targeting proteinů: Signální sekvence polypeptidu, volné a vázané ribozómyPosttranslační glykosylace proteinůTargeting nezávislý na glykosylaci proteinůTargeting mitochondriálních proteinůTargeting jaderných proteinůRozhodovací mechanismus k destrukci nefunkčních proteinůReceptorem zprostředkovaná endocytóza
Biochemie virů: Reprodukce DNA virůReprodukce RNA virůInterferony
Biochemie genového inženýrství: Štěpení DNA na definovaném místě řetězceÚčinné dělení fragmentů DNA elektroforézouIdentifikace restrikčních fragmentůSyntéza umělé DNAPomnožení a exprese izolovaného nebo umělého genu v hostitelské buňce


Zdroj

  • ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Praha : Medprint, 1998. ISBN 80-902036-2-0.


Použitá literatura

  • ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Praha : Medprint, 1998. ISBN 80-902036-2-0.