Principy enzymové histochemie
Enzymová histochemie (též nazývaná katalytická histochemie) je metoda sloužící k detekci aktivity enzymů v buňkách nebo tkáních organismu. V současnosti je in situ prokázáno asi 150 enzymů, tj. asi 1/10 z celkového počtu enzymů. Samotný princip katalytické aktivity spočívá ve dvou krocích.
První krok je samotná histochemická reakce"': tkáň s enzymem + substrát = produkt.
Druhý krok je "reakce vizualizace": z testovaného produktu první reakce vznikne barevná a nerozpustná sloučenina.
Aby proběhly obě tyto výše uvedené reakce musí být dodrženy určité podmínky.
- Zachování aktivity enzymů
- Zachování struktury buněk a tkání - kryostatové řezy (chemická fixace téměř vždy snižuje aktivitu enzymu)
- Ph prostředí
- Substrát v nadbytku
Tyto optimální podmínky zajistíme pomocí inkubačního prostředí, které má tyto složky:
- Substrát: ten by měl být rozpustný ve vodě při pH optimální pro daný enzym a měl by mít schopnost vytvářet barevný finální produkt a zároveň dostatečně rychle pronikat do míst fyziologické lokalizace enzymu. Pokud je produkt reakce bezbarvý, přidává se do IP činidlo sloužící k jeho zviditelnění.
- Aktivátory: tj. látka zvyšující aktivitu enzymu
- Inhibitory: tj. látka snižující aktivitu enzymu
- Vhodný pufr: zajistí potřebné pH optimum (fosfátový, citranový, tris-maleátový, octanový, aj.)
Nejprve tedy nabídneme enzymu vhodný substrát:
| Enzym | Funkce |
|---|---|
| oxidoreduktázy | katalyzují oxidační nebo redukční reakce |
| transferázy | přenášejí chemické skupiny z jedné mlk na druhou |
| hydrolázy | štěpí esterové, glykosidické a peptidové vazby za přítomnosti vody |
| fosfatázy |
různé fosfáty
|
| dehydrogenázy | oxidovatelný substrát odštěpující vodík |
| peroxidázy | peroxid vodíku |
| esterázy | hydrolyzovatelný ester |
| glykosidázy | glykosidická vazba (cukry, glykoproteiny,glykolipidy) |
| sulfatázy | sulfoestery |
| nukleotidázy | nukleotidový řetězec |
| proteázy | protein nebo peptid |
| ligázy | katalyzují syntetické reakce za současného štěpení ATP. |
Poté zviditelníme reakční produkt reakcí s chromogenem – vizualizační reakce:
| Precipitace s kationty kovů | vznik barevné nerospustné soli Pb, Co |
| Simultanní azokopulace | produkt (naftol) se převede na azobarvivo |
| Indigogenní reakce | štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo |
| Tetrazoliová metoda | redukce tetrazoliové soli na barevný formazan |
| Peroxidázová reakce | oxidace DAB (diaminobenzidin) |
Samotné provedení[upravit | editovat zdroj]
- Průkaz se provádí na volných řezech (na hod. sklíčku nebo v malinkých Petriho miskách v inkubačním roztoku) nebo na řezech adhezí přilepených na podložní sklíčko.
- Inkubace 37 °C nebo laboratorní teplota. Délka inkubace je od několika minut až do dvou hodin (závisí na množství enzymu ve tkáni a citlivosti metody)
- Fixace:
- čerstvé kryostatové řezy z nefixované tkáně
- řezy z fixovaných vzorků
- řezy připravené lyofylizací
- Každý histochemický průkaz je třeba doplnit o kontrolní pokus a inhibiční testy.
Kontrolní pokus: slouží k verifikaci výsledků a provádí se jednoduše tak, že se v inkubačním roztoku vynechá substrát.
Inhibiční testy: jsou indikovány v těch případech, kdy stejný substrát je atakován několika enzymy současně.
Odkazy[upravit | editovat zdroj]
Použitá literatura[upravit | editovat zdroj]
- ŠPAČEK, Martin. Enzymová histochemie [online]. [cit. 2011-05-23]. <http://histologie.lf3.cuni.cz/histologie/materialy/doc/histochemie-tisk.pdf>.
- WikiSkripta. Fluorescence [online]. [cit. 2011-05-23]. <https://www.wikiskripta.eu/w/Fluorescence>.
- Masarykova univerzita v Brně, Lékařská fakulta - Ústav histologie a embryologie. Alkalická histochemie [online]. [cit. 2011-05-23]. <http://www.med.muni.cz/histology/MedAtlas_2/OH_txt1-3-5-2.htm>.
- TONAR, Zbyněk. Zymografie [online]. [cit. 2011-05-23]. <http://web.lfp.cuni.cz/histologie/education/guides/ihc/node26.html>.
- SMETANA, Karel. Kaltalztická histochemie [online]. [cit. 2011-05-23]. <http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylaby-prednasek/textova-verze-prednasek/mikroskopicke-metody-smetana.pdf>.
