Warburgův optický test

Z WikiSkript
Oxidace a redukce NAD

Když Otto Heinrich Warburg (1883–1970), německý biochemik a později nositel Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství (1931), poprvé využil ke sledování reakce katalyzované enzymem absorpčních vlastností pyridinových koenzymů, netušil patrně, jak významně se tento objev uplatní v klinické chemii. Převážná většina dnes rutinně používaných metod ke stanovení aktivity enzymů je založena přímo nebo nepřímo na fotometrii absorbance reakčních směsí, které obsahují pyridinový koenzym. Tento princip dal také metodě její označení „optický test“.

Reverzibilní hydrogenace nikotinamidadenindinukleotidu (NAD+), která nastává na pyridinovém kruhu nikotinamidu, vede k redukované formě (NADH + H+) a je provázena výraznou změnou absorpčního spektra. Zatímco oxidovaná forma (NAD+) má absorpční maximum při vlnové délce 260 nm, je zrušení aromatického charakteru pyridinového jádra a jeho přechod v chinoidní formu (NADH + H+) provázeno vznikem dalšího absorpčního maxima při 340 nm.

Velikost, případně změny absorbance při vlnové délce 340 nm jsou přímo úměrné počtu redukovaných molekul koenzymu. Přeměna jednoho molu koenzymu zase odpovídá přeměně jednoho molu substrátu, a navíc lze tuto přeměnu sledovat v čase, tedy kontinuálně měřit rychlost reakce pomocí spektrofotometru.

Tak je možné připravit reakční směs ze sledovaného enzymu (nebo biologického materiálu, v němž ho stanovujeme), koenzymu a příslušného substrátu v optimální koncentraci, a za optimálního pH i teploty zjišťovat reakční rychlost měřením změn absorbance na vhodném fotometru při vlnové délce 340 nm.


Spřažené reakce[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Vzhledem ke skutečnosti, že NAD+ je koenzymem jen některých dehydrogenas a že existuje řada klinicky významných enzymů z jiných tříd než jsou právě oxidoreduktázy, používá se vedle „jednoduchého optického testu“ ještě častěji „složených optických testů“, kdy se výše uvedeného principu využívá pouze jako indikátorové reakce, zatímco vlastní reakce měřící aktivitu příslušného enzymu je předřazena nebo dokonce spřažena v celou sérii s dalšími pomocnými reakcemi.

enzym reakce pomocná reakce indikační reakce
alaninaminotransferasa EC 2.6.1.2 alanin + 2-oxoglutarát \rightleftharpoons glutamát + pyruvát LD:

pyruvát + NADH + H+ \rightleftharpoons laktát + NAD+

kreatinkináza EC 2.7.3.2 kreatinfosfát + ADP → kreatin + ATP HK

glukóza + ATP → Glc-6-P + ADP

Glc-6-PD

Glc-6-P + NADP+ \rightleftharpoons 6-P-glukonát + NADPH + H+

Vysvětlivky:

LD – laktátdehydrogenáza (EC 1.1.1.27)
HK – hexokináza (EC 2.7.1.1)
Glc-6-PD – glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (EC 1.1.1.49)
Glc-6-P – glukóza-6-fosfát

Jako indikační reakce se také často používá peroxidasová reakce, např. při stanovení glukózy či cholesterolu.

analyt reakce indikační reakce
glukóza GOD
glukóza + O2 → glukonová kyselina + H2O2
POD
H2O2 + fenol + 4-aminoantipyrin → chinonimin (růžový) + 4 H2O
cholesterol CHE
cholesterol + O2 → 4-cholesten-3-on + H2O2
POD
H2O2 + fenol + 4-aminoantipyrin → chinonimin (růžový) + 4 H2O

Vysvětlivky:

GOD – glukózaoxidáza (EC 1.1.3.4)
CHE – cholesteroloxidáza (EC 1.1.3.6)
POD – peroxidáza (EC 1.11.1.7)