Izolace buněk

První podmínkou pro založení tkáňové kultury je izolace buněk, které se budou pěstovat. Výchozím materiálem přitom bývá orgán sterilně odebraný z pokusného zvířete, vzácněji bioptický vzorek či např. punktát kostní dřeně nebo vzorek periferní krve.

Je-li výchozím materiálem solidní orgán, jsou v zásadě dvě možnosti, jak z něj vytvořit buněčnou kulturu:

1. tkáň se rozřeže na malé částečky, které se ponoří do kultivačního média. Buňky pak z částeček vyrůstají a šíří se po povrchu kultivační nádoby
2. tkáň se rozvolní na jednotlivé buňky, ať už mechanicky homogenizátorem, nebo – šetrněji – např. enzymatickým natrávením (trypsinem, kolagenázou, pronázou, dispázou, elastázou apod.).

Oběma způsoby však vzniká směs mnoha buněčných typů, ze které je nutné žádanou subpopulaci izolovat. Buď lze využít různé odolnosti jednotlivých typů buněk vůči různým podmínkám, jejich náročnosti na složení kultivačního média, citlivosti vůči toxickým látkám apod., nebo lze buňky rozdělit podle jejich fyzikálních vlastností, nejčastěji podle hustoty nebo rychlosti sedimentace.

K izolaci buněk podle hustoty (izopyknická sedimentace) se používá centrifugace buněčné suspenze ve zkumavce naplněné médiem, které má v různých vzdálenostech ode dna různou denzitu – tzv. dělení na gradientu hustoty. Hustota gradientu se může měnit:

• buď plynule (spojité gradienty)
• skokem (nespojité gradienty).

Tvorba spojitých gradientů

K vytvoření spojitého gradientu se dnes nejčastěji používá částeček oxidu křemičitého potažených polyvinyl – pyrrolidonem (obchodní název Percoll®). Pokud se směs částic o různé velikosti centrifuguje při vysokých otáčkách, rozdělí se podle denzity. Médium u dna zkumavky má pak vyšší hustotu než médium u hladiny. Na povrch gradientu se nanese buněčná suspenze a celý sloupec se znovu centrifuguje, tentokrát při podstatně nižších otáčkách. Buňky klesnou až na úroveň, kde mají stejnou hustotu jako médium. Odebráním vhodné části sloupce lze izolovat jeden určitý buněčný typ. Jinou možností, jak připravit spojitý gradient, je postupné míšení dvou roztoků, jednoho s vyšší a druhého s nižší hustotou, přičemž poměř obou roztoků se plynule mění a výslednou směsí se plní centrifugační zkumavka.

Tvorba nespojitých gradientů

Technicky jednodušší je příprava nespojitých gradientů. V tomto případě se na sebe jednoduše navrství roztoky o různých hustotách. Další vrstvu opět tvoří buněčná suspenze. Po centrifugaci se buňky rozdělí mezi jednotlivá rozhraní roztoků tak, že každý buněčný typ zůstane mezi roztokem s vyšší a nižší hustotou, než je hustota buněk. K přípravě diskontinuálních gradientů se používá celá řada chemikálií. Nejčastěji jde o sacharidy, od snadno dostupné sacharózy až po polysacharidy (např. mnohočetně rozvětvený kopolymer sacharózy a epichlorhydrinu s přesně definovanou molekulární hmotností, obchodní název Ficoll®).

Odkazy

Zdroj

• VEJRAŽKA, Martin. Základní techniky práce s tkáňovými kulturami [přednáška k předmětu Biochemie, obor Všeobecné lékařství, 1. LF UK]. Praha. 2004.