Spektrofotometrie pro praktická cvičení 2.LF UK

Z WikiSkript

Zadání úlohy

Úkol 1. Měření absorpčního spektra

Proměřte, určete a charakterizujte absorpční spektrum roztoku malachitové zeleně a indigotinu.

Úkol 2. Určení koncentrace neznámého vzorku a Lambert-Beerův zákon

Pomocí měření absorbance vzorků o známé koncentraci zkonstruujte kalibrační křivku.

Na základě Lambert-Beerova zákona určete koncentraci neznámého vzorku.


Teoretický úvod

Spektroskopie je fyzikálně-chemická disciplína, která se zabývá vznikem a vlastnostmi všech druhů spekter, interakcemi mezi hmotou a elektromagnetickým zářením. Zkoumá závislosti absorpce, emise nebo rozptylu elektromagnetického záření jako funkce vlnové délky (λ) nebo frekvence (f). Interpretací výsledků můžeme získat informace o kvantitě a kvalitě zkoumaných látek. Spektrofotometrie je jedním z oborů spektroskopie, zabývá se kvantitativním studiem spekter, to znamená měřením množství světla propuštěného, odraženého nebo pohlceného jistou látkou v závislosti na vlnové délce.

Jednou z charakteristických optických vlastností látek je absorpce záření. Při interakci elektromagnetického záření (světla) vhodné vlnové délky s částicemi látky dochází k využití energie fotonu (absorpci) pro excitaci valenčních elektronů. Intenzita prošlého světla (I) je tedy menší než intenzita světla na látku dopadajícího (I0). Platí pro ni tzv. Lambertův zákon: [math]I=I_0 \cdot 10^{-\mu \cdot l}[/math]

kde l je tloušťka absorbující vrstvy. Veličina μ se nazývá lineární absorpční koeficient. Poměr intenzit prošlého a dopadajícího světla nazýváme transmitancí (T):[math]T=\frac{I}{I_0}[/math]Může nabývat hodnot 0 (veškeré záření pohlceno) až 1 (veškeré záření prošlo; při fluorescenčních látkách může být větší než 1) a někdy se udává i v procentech. Záporný dekadický logaritmus transmitance nazýváme absorbancí (A). Platí tedy[math]A=-log T = -log \left ( \frac{I}{I_0} \right ) = \mu\cdot l[/math]Spektrum, které vzniklo průchodem světla určitou látkou, nazýváme spektrem absorpčním, jedná se tedy o grafickou závislost absorbance nebo na vlnové délce.

Pro absorpci v roztocích platí Beerův zákon: Absorpční koeficient roztoku je přímo úměrný koncentraci. Koncentraci c udáváme obvykle jako molární, a proto veličinu ε (konstantu úměrnosti) nazýváme molární absorpční koeficient ε. Je specifický pro danou látku a vlnovou délku (viz dále). Kombinaci obou vztahů píšeme jako tzv. Lambert-Beerův zákon [math]A=\varepsilon\cdot l\cdot c[/math]

(Z toho plyne, že transmitanci můžeme pomocí úprav vyjádřit jako: [math]T = 10^{-\epsilon \cdot l \cdot c}\,\![/math])


Absorbance je tedy přímo úměrná koncentraci látky c a tloušťce absorbující vrstvy l, to znamená délce optické dráhy neboli šířce kyvety (obvykle 1 cm). Platnost Lambert-Beerova zákona je omezena pouze na monochromatické světlo, konstantní délku kyvety, stejné rozpouštědlo (vliv pH, teploty), analytická koncentrace látky je rovna koncentraci v její absorbující formě.

Zkoumáním spektroskopických vlastností ve viditelné (VIS) a ultrafialové (UV) oblasti spektra se zabývá UV/vis spektroskopie a fotometrie. Využívá světlo z UV oblasti (vlnová délka 10–390 nm), viditelné oblasti (vlnová délka 390–790 nm) a přilehlé infračervené oblasti (vlnová délka 770 nm – 1 mm). UV/vis spektrofotometrie umožňuje díky platnosti Lambert-Beerova zákona zjistit neznámou koncentraci neznámých roztoků látek. Ta se určuje dvěma způsoby: metodou kalibrační křivky (viz Úloha 2) a metodou standardního přídavku.

Metoda kalibrační křivky je postup, kdy se změří absorbance několika kalibračních roztoků o různých koncentracích, a to ve stejné kyvetě a při stejné vlnové délce. Z průběhu kalibrační křivky můžeme ověřit platnost Lambert-Beerova zákona. Výsledná závislost by v ideálním případě měla být lineární, procházející počátkem - tzv. kalibrační přímka. Tato metoda je ovšem použitelná jen pro jednoduchou matrici (např. pitnou vodu).

Metoda standardního přídavku je postup, během kterého se změří absorbance neznámého vzorku Avz a pak se koncentrace látky ve vzorku zvýší definovaným přídavkem standardu a změří se odpovídající absorbance roztoku. Touto metodou se dá stanovit látka ve složité matrici (např. v odpadní vodě), kdy stanovení metodou kalibrační křivky by bylo poměrně složité.


Stanovení koncentrace neznámé látky pomocí rovnice lineární regrese

Pomocí rovnice lineární regrese y = a + b · x vyjádříme teoretickou závislost naměřené absorbance vzorku na koncentraci. Vzorec obecné rovnice lineární regrese vychází z Lambert-Beerova zákona. Obsahuje dvě proměnné (x, y) a dva regresní koeficienty (a, b). Obě proměnné můžeme snadno nahradit veličinami z grafu kalibrační křivky, která nám vyjadřuje závislost absorbance na koncentraci. Tudíž x znamená koncentraci (c) a y absorbanci (A). Rovnice by tedy měla správně znít A = a + b · c.

Regresní koeficient a vyjadřuje možnou systematickou chybu měření (případně odchylky způsobené nečistotami na stěně kyvety apod.). Tím, že předpokládáme jeho existenci, tyto chyby "odfiltrujeme".

Lineární člen b · c již odpovídá "čistému" Lambert-Beerovu zákonu. Podle něj je absorbance roztoku rovna A = ε · l · c . Koncentrace vystupuje v obou výrazech, proto můžeme říci, že koeficient regrese b se rovná součinu molárního extinkčního koeficientu a šířky kyvety: b = ε · l. Tento prvek nám v rovnici regrese vyjadřuje směrnici přímky. Odtud určíme molární extinkční koeficient ε = b / l. Musíme však dát pozor na jednotky, neboť k koncentrace je udána v mikromolech na litr (μMol/L), zatímco šířku kyvety máme změřenou v centimetrech.


Princip měření

Pro spektrofotometrická stanovení se používají fotometry a spektrofotometry. Zařízení, která měří při jedné nebo jen několika přesně definovaných vlnových délkách monochromatického světla, označujeme jako fotometry. Technicky složitější a dokonalejší přístroje, které umožňují vlnovou délku monochromatického světla libovolně nastavit nebo měřit část absorpčního spektra v určitém úseku vlnových délek, se nazývají spektrofotometry. Měří intenzitu světla po průchodu vzorkem (I) a dává ji do poměru k intenzitě světla před průchodem vzorkem (Io). Na základě výše uvedených vztahů mezi veličinami můžeme určovat například transmitanci, absorbanci, koncentraci vzorku.

Schéma spektrofotometru

Spektrofotometr se skládá z těchto částí:

• Zdroj záření (halogenová lampa pro VIS a deuteriová pro UV oblast)

• Čočky a zrcadla usměrňující paprsek světla

• Monochromátor (zařízení propouštějící pouze světlo určité vlnové délky) - jako monochromátor dnes slouží obvykle optická mřížka, jejímž nakláněním lze plynule vlnovou délku měnit. Rozsah vlnových délek, které z monochromátoru vycházejí, určuje štěrbina, buď pevně nastavená, nebo rovněž nastavitelná. Čím je štěrbina širší, tím větší je intenzita vycházejícího světla, ovšem za cenu menší specifičnosti měření. Naopak užší štěrbina zajistí přesnější dodržení požadované vlnové délky, ovšem za cenu menší intenzity světla a zhoršení odstupu signálu od šumu.

• Kyvetový prostor – prostor na vzorky v kyvetách z plastu, skla nebo křemenného skla

• Detektor (CCD kamera anebo fotodioda) - Přesnost měření ovlivňuje integrační čas – doba, po kterou se absorbance měří. Čím je delší, tím přesnější bude výsledek měření, pokud ovšem není absorbující látka fotocitlivá (tj. pokud nedojde při delším osvitu k vyblednutí vzorku). Nevýhodou dlouhého integračního času je samozřejmě také prodlužování doby měření, což je podstatné zejména při zpracování velkého množství vzorků, při měření při velkém počtu vlnových délek (tj. při měření spekter), nebo při zpracování vzorků, které se v čase mění (kinetická měření).

• Výstupní zařízení (software na analýzu dat, často také počítač)


Podle počtu paprsků využívaných k měření rozlišujeme jedno anebo dvoupaprskové spektrofotometry. U dvoupaprskového spektrofotometru jeden paprsek měří stanovovaný vzorek, druhý tzv. slepý vzorek neboli „blank“ (rozpouštědlo bez stanovované látky). Při použití jednopaprskového přístroje musíme nejdříve změřit vlastnosti slepého vzorku, tedy provést referenční měření rozpouštědla a teprve potom měřit vzorek.

Moderní spektrofotometry jsou automatizované a plně ovladatelné pomocí počítače. Využívají se k měření absorpčních spekter (širší spektrum vlnových délek) anebo kvantitativní měření (při jedné anebo několika vlnových délkách). Umožňují také měření kinetiky jednoduchých, například enzymových reakcí. Proto spektrofotometrické metody nacházejí široké uplatnění – v oborech chemie, fyziky, biochemie, biologie i medicíny.

V praxi je však platnost Lambert-Beerova zákona limitovaná rozptylem světla v důsledku jemných nečistot ve vzorku, fosforescencí anebo fluorescencí vzorku, malým množstvím procházejícího světla při vysokých koncentracích, změnami hodnot absorpčního koeficientu a posunem chemické rovnováhy způsobeným vysokou koncentrací látky ve vzorku.


Využití v medicíně

Spektrofotometrie mozkomíšního moku se využívá v diagnóze náhlých cévních mozkových příhod především při podezření na krvácení do subarachnoidálního prostoru. Poskytuje informaci o stáří krvácení a o protrahovaném čiopakovaném krvácení. Spektrofotometrické vyšetření mozkomíšního moku ve viditelné části spektra umožňuje charakterizovat na základě rozdílných absorpčních maxim oxyhemoglobin, methemoglobin a bilirubin.

SPECORD 40


PRAKTICKÁ ČÁST

Spektrofotometr SPECORD 40. Jednoparskový spektrofotometr, který měří v oblasti vlnových délek 190–1100 nm (pro 190–300 nm deuteriová lampa a pro 300–1100 nm halogenová lampa). Umožňuje měření absorbancí v intervalu hodnot A = (–3)–(+3). Lze ho ovládat z hlavního panelu na přístroji a také pomocí programu WinASPECT, který současně umožňuje jednoduchou a rychlou analýzu dat.

SPECORD 40

Malachitová zeleň absorbuje v modré a červené oblasti spektra (oblasti viditelného záření).

Indigotin (Indigocarmin) absorbuje pouze v červené oblasti spektra (oblasti viditelného záření).


Ukládání souborů a jejich názvy

Všechny soubory vytvořené během praktické části této úlohy ukládejte do adresáře Praktikum_CZ (odkaz najdete na ploše). Jako název souboru vždy uvádějte název Vaší skupiny - prvním znakem je číslo Vašeho kruhu a druhým pak písmeno Vašeho týmu (např. kruh 9 skupina C => název bude 9C).


Bezpečnostní upozornění

S roztoky pracujte v rukavicích, nevdechujte je ani nepožívejte.

• Spektrofotometr je zařízení citlivé na vlhkost. S kapalinami pracujte opatrně! Při případném vylití politý prostor okamžitě osušte!


Úkol 1. Měření absorpčního spektra

Ilustrační obrázek k bodu č. 5

Chemikálie:

Roztoky KA4 a KB

Destilovaná voda

Postup práce

1. Zapněte spektrofotometr síťovým vypínačem na zadní straně přístroje

2. Zapněte PC

3. Spusťte program WinASPECT (START/PROGRAMY/WinASPECT/WinASPECT)

4. Po spuštění programu otevřete panel Measurement na horním panelu a zvolte Inicialize device. Po potvrzení volby se objeví otázka na použití UV lampy, kterou zamítneme. Spektrofotometr automaticky spustí inicializaci a vnitřní kalibraci.

Panel Settings

5. Po dokončení inicializace nastavte parametry měření. V nabídce Measurements zvolte možnost Set Parameters. Objeví se panel nastavení parametrů. Kliknete na New na panelu nastavení parametrů.

Nastavení parametrů

Některé parametry jsou přednastavené. Pro správné nastavení měření nastavte následující:

Panel Settings:

• V okně Title vyplňte název dle názvu Vaší skupiny (instrukce uvedené výše).

Panel Mode
   ◦ Funkce Cycle Mode deaktivovaná výběrem možnosti None
   ◦ Funkce Display – vyberte možnost Absorbance
   ◦ Funkce Correction – vyberte možnost Reference

Panel Mode:

• V okně Meas. Mode vyberte možnost Scan Mode

• Nastaveni funkce Scan Mode nastavte následující hodnoty:

Panel Measurement
Range = 375– 675 nm (výběr šířky sledovaného spektra)
   ◦ Delta lambda = 1 nm (výběr délky intervalů měření)
   ◦ Speed = 50 nm/s (výběr rychlosti měření)

Po nastavení parametrů klikněte na ikonu OK na panelu nastavení měření. Objeví se okno možnosti uložení. Soubor uložte do výše uvedeného adresáře pod názvem své skupiny. Po uložení zavřete okno nastavení měření.

Okno Serial Measurement

6. Spektrofotometr je nyní připraven pro vlastní měření. Nyní je otevřen panel Measurement. Vyberte možnost Serial measurement.


7. V programu WinASPECT je nyní aktivní otevřené okno Serial Measurements. Pro nastavení parametrů měření vyberte z nabídky Edit v panelu nástrojů možnost Setup.

Nastavte následující parametry:

• Panel General: Descriprtion: zadejte název své skupiny.

• Panel Samples: Number of measurements: zadejte počet vzorků (v tomto případě 2).

Vzorek číslo Název vzorku Koncentrace [...........]
1 KA4
2 KB

8. Před měřením vzorků je nezbytné provést referenční měření pomocí slepého vzorku, tzv. blanku (rozpouštědlo bez stanovované látky). Vzorky – barviva – jsou rozpuštěné v destilované vodě, proto použijte jako blank destilovanou vodu. Do kyvety nalijte destilovanou vodu tak, aby její hladina sahala do 1/2 kyvety (přibližně k vrcholu úzké části).

Kyvetu vždy držte za matné strany. Světelný paprsek prochází čirými stranami a jejich znečištěním (včetně otisků prstů) může dojít ke zkreslení výsledků měření. Proto kyvetu před měření otřete dosucha a současně setřete případné nečistoty a otisky prstů (např. suchou buničinou).

9. Otevřete prostor na vkládání vzorků. Do držáku na kyvety vložte kyvetu s blankem. Poté zavřete dvířka prostoru pro vzorky. Kyvetu vkládáme co nejtěsněji ke stěně držáku, tak aby čirými plochami mohl procházet světelný paprsek. Dbejte, aby kyveta stála v držáku kolmo!

Spektrofotometr je přístroj citlivý na vylití kapalin. Pracujte proto opatrně. V případě vylití kapaliny opatrně vysušte polité místo!

10. Spusťte referenční měření kliknutím na ikonu Reference v panelu nástrojů okna Serial Measurement. Spektrofotometr proměří absorpční spektrum blanku.

Ilustrační obrázek k bodu č. 10



11. Po provedení referenčního měření je spektrofotometr připravený pro měření vzorků. Měření vzorků spusťte kliknutím na ikonu Start. Do čisté kyvety nalijte první vzorek (KA4) a umístěte kyvetu do držáku kyvet (viz body 8 a 9). Použijeme nejkoncentrovanější roztoky barviv, protože dle Lambert-Beerova zákona je koncentrace přímo úměrná absorbanci, a tedy výsledná křivka spektra bude výraznější. Zavřete víko spektrofotometru a v programu potvrďte vložení vzorku („OK“). Spektrofotometr proměří absorpční spektrum prvního vzorku.

Ilustrační obrázek k bodu č. 11 - první část
Ilustrační obrázek k bodu č. 11 - druhá část


12. Po ukončení měření prvního vzorku vložte do kyvety druhý vzorek a opět potvrďte vložení.

13. Po změření všech vzorků se zobrazí tabulka obsahující naměřené hodnoty absorbance při dané vlnové délce (panel Table) nebo grafické zobrazení hodnot v tabulce (panel Grafic).

Ilustrační obrázek k bpdu č. 13 - první část
Ilustrační obrázek k bodu č. 13 - druhá část


14. Kliknutím na možnost To document na panelu nástrojů okna Serial measurements převeďte výsledky do podoby dokumentu. Uložte jej pod názvem své skupiny. Dokument umožňuje prohlížení hodnot v tabulce i hodnot absorbance a transmitance vztažených k vlnové délce.

15. Výsledky vytiskněte.

Tisk výsledků


Úkol 2. Určení koncentrace neznámého vzorku a Lambert-Beerův zákon

Podle Lambert-Beerova zákona je závislost absorbance na koncentraci v určitém rozsahu koncentrací lineární. Před měřením neznámých vzorků je potřebné určit koeficient úměrnosti. Proto konstruujeme kalibrační křivku pomocí měření absorbance vzorků o známé koncentraci.

Chemikálie:

Čtyři roztoky indigotinu o různých koncentracích (roztoky KA1, KA2, KA3, KA4), roztok o neznámé koncentraci (NA).

Postup práce:

Kalibrační křivka

Před začátkem úlohy stanovte podle spekter naměřených v úkolu č. 1 vhodnou vlnovou délku pro měření absorbance pro roztoky KA, KB a pro oba roztoky ve směsi (odpověď na body č. 1 a č. 2 v úkolu 1).

Číslo vzorku Název vzorku Koncentrace [μM/l]
1 KA1
2 KA2
3 KA3
4 KA4

Nejprve si sestavíme kalibrační křivku, která zobrazuje závislost přístrojem naměřené absorbance na koncentraci roztoku. Program na základě kalibrační křivky vypočítá hodnoty potřebné pro vypočtení molárního extinkčního koeficientu a nakonec určí neznámou koncentraci vzorku v kyvetě.

Calibration

1. V programu WinASPECT zvolte z nabídky Quant na panelu nástrojů možnost Calibration.


2. Na obrazovce se zobrazí okno Calibration pro nastavení parametrů měření.

Plocha General:

• Název skupiny (Designations): název Vaší skupiny

Plocha General

• Model regrese (Regresion Model): zvolte možnost: y = A + B*x

• Vlnová délka (WAVELENGHT1 (nejvhodnější společná pro roztoky KA4 a KB): zvolte na základě naměřených hodnot v úkolu 1.

• Jednotky koncentrace (Calibration Unit): zvolte podle jednotek uvedených na vzorcích

• Měřená veličina (Ordinate): absorbance

• Šířka kyvety (Cell Pathlenght): změřte šířku kyvety

• Počet standardů (No. of Standards): 4 pro KA

Parameter file: 9C.par (příklad - 9 – devátý kruh, C – tým C)


3. Na panelu Mode z nabídky Meas. mode vyberte možnost Wavelenghts. Vhodnou vlnovou délku zvolíte klinknutím na možnost Edit. Nasledně napište hodnotu vlnové délky a pro potvrzení opět klikněte na ikonu Edit. Kliknutím na ikonu OK se vrátíte do nabídky Calibration.

Edit - panel Mode


.


Ikona Standards


4. Po návratu do nabídky Calibration a zadání výše uvedených parametrů klikneme na ikonu Standards.

5. Po kliknutí na ikonu Standards se otevře okno; vyplňte koncentrace jednotlivých standardů v příslušných jednotkách.

Standard: vyplňte názvy standardů

Conc.: do příslušných polí vyplňte hodnoty koncentrací

Source: hodnota zadaná automaticky

6. Změřte absorbanci referenčního vzorku (blank). Kyvetu naplněnou destilovanou vodou vložte do držáku kyvet a kliknutím na ikonu Reference proveďte referenční měření.

7. Klikněte na ikonu Start a vložte vzorek KA1. Poté změřte vzorky KA2, KA3, KA4 v pořadí udaném v tabulce. Po ukončení měření všech vzorků klikněte na ikonu OK.

8. Otevře se okno Calibration s grafickým znázorněním kalibrační křivky a rovnicí regresní přímky.

Kalibrační křivka


9. Soubor uložte přes File a Save as pod názvem své skupiny. Kalibrační křivku vytiskněte přes File a Print. Při kliknutí na Print se vám zobrazí okno Print - Calibration. V okne mějte zaškrtnuté jenom první čtyři možnosti (Calibratiion curve, Parameters, Standards a Statistics). Pokud je poslední možnost Audit trail zaškrtnuta, tak jí odškrtněte. Vlastní tisk spustíte kliknutím na ikomu Print v okně Print - Calibration.

Kalibrační křivku je možné uložit i po kliknutí na ikonu To Conc.

Určení koncentrace neznámého vzorku (pro vzorek NA)

10. Po uložení program automaticky otevře okno Concentration, které umožňuje stanovit koncentrace neznámých vzorků na základě kalibrační křivky.

Concentration


11. Pro měření koncentrací neznámého vzorku vložte vzorek v kyvetě do držáku kyvet a kliknutím na ikonu Start (Meas.) přístroj změří absorbanci a na základě koeficientů kalibrační křivky vypočítá koncentraci neznámého vzorku.

12. Po ukončení měření se hodnoty koncentrace zobrazí v tabulce.

Tabulka - měření koncentrace neznámého vzorku


13. Uložte dokument pod názvem své skupiny a hodnotu změřené koncentrace si zapíšte do protokolu.

Uložení dokumentu


14. Po ukončení měření použité kyvety opláchnete destilovanou vodou ze střičky.

Literatura

Amler E. et al. Praktické úlohy z biofyziky I. Ústav biofyziky UK, 2. lékařské fakulty, Praha 2006

Navrátil L. et al. Medicínská biofyzika, Grada Praha 2005

On-line educational hypermedia – Hypermedia for Science Education) – http://elchem.kaist.ac.kr/vt/index.htm

UV VIS Spektrofotometry SPECORD® 50, SPECORD® 40, SPECORD® 30 se zabudovaným ovládáním. Provozní příručka. Analytik Jena AG. ChromSpec srov.o. Číslo publikace: 221:408.23, Vydání – únor 2002

WinASPECT®. Uživatelská příručka

Wikiskripta 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze https://www.wikiskripta.eu/w/Spektrofotometrie_(2._LF_UK) (21.10.2017)