Zpracování tvrdých tkání pro histologické účely

Tvrdé tkáně, jako je např. kost nebo zub, obsahují velké množství anorganických solí, které je nutné před zpracováním tkáně odstranit – odvápnit (dekalcifikovat). Pokud tkáň obsahuje příliš velké množství anorganických solí (sklovina), po odvápnění se rozpadne.

Kyseliny

• všechny kyseliny (i když dobře pufrované) poškozují tkáň a narušují její barvitelnost (včetně antigenicity)
• problém narůstá s klesajícím pH roztoku a dobou dekalcifikace
• rychlá dekalcifikace poškozuje tkáň více než pomalá

• Silné anorganické kyseliny
  • využívají se vodné roztoky kyseliny chlorovodíkové a dusičné o koncentraci 5-10 %
  • dekalcifikace je rychlá, ale nešetrná
  • doba působení je 24-48 hod
  • využívají se v případě nutnosti rychlé diagnózy

• Organické kyseliny
  • používá se kyselina mravenčí v koncentraci 5-10 %
  • kyselina mravenčí je slabá kyselina - odvápnění je pomalejší a šetrnější než v případě použití anorganických kyselin
  • délka dekalcifikace je 1-10 dní a závisí na velikosti a typu vzorku

Chelační činidla - EDTA (etylendiamintetraoctová kyselina)

• EDTA váže kationty (hlavně kalcium a magnezium) k optimální vazbě kationtů dochází při pH 8
• EDTA váže ionty vápníku přítomné na vnější straně krystalu hydroxyapatitu - odstraňováním vnějších vrstev se krystal zmenšuje
• odvápnění je pomalé a nepoškozuje tkáň ani její barvitelnost
• kompletní dekalcifikace denzní kosti trvá 6-8 týdnů
• odvápňovací roztok se pravidelně vyměňuje

Dekalcifikační proces je nutné v jeho průběhu kontrolovat, aby nebyl vzorek dekalcifikačním činidlům vystaven déle, než je nezbytně nutné

• pomocí jehly či ohýbání tkáně není příliš vhodné - dochází ke vzniku artefaktů či poškození
• pomocí chemické reakce
  • pokud není v dekalcifikačním roztoku prokázána přítomnost vápníku, odvápnění je kompletní
  • využívá se reakce s hydroxidem amonným a šťavelanem amonným

Po dekalcifikaci je nutné odstranit dekalcifikační činidlo, např. oplachem ve vodě. Následně je tkáň dehydrována, projasněna a zalita do zalévacího média.

Odkazy

Použitá literatura

• ČÍŽKOVÁ, Kateřina. Základy histochemických metod. - vydání. Univerzita Palackého v Olomouci, 2018. 50 s. ISBN 9788024453163.