Konstrukce a funkce světelného mikroskopu

Z WikiSkript
Hlavní součásti světelného mikroskopu: 1) okuláry, 2) otočný revolver, 3) objektivy, 4) makrošroub, 5) mikrošroub, 6) stolek, 7) světelný zdroj, 8) kondenzátor a clona, 9) křížový posun

Světelný mikroskop je komplexní optický přístroj, který pomocí několika optických soustav zvětšuje zorný úhel oka, a tím zlepšuje jeho rozlišovací schopnost až tisíckrát. [1]

Rozlišovací mez oka je za normálních podmínek asi 0,2 mm, rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je asi 200 nm. [1]
Součásti světelného mikroskopu a jejich funkce

Moderní světelný mikroskop se skládá z tří základních optických soustav:

Tyto části jsou doplněny mechanickou soustavou v jeden funkční celek. Ve vývojově starších mikroskopech bylo běžné používání pouze jedné dvojvypouklé spojovací čočky a světla kahanu nebo svíce [2].


Světelný mikroskop je používán zejména pro svou relativně snadnou výrobu a schopnost pozorovat preparáty dynamicky, bez jejich poškození (na rozdíl od mikroskopů využívajících jiné typy elektromagnetického záření) a se zachováním barvy (na rozdíl od elektronových mikroskopů).

Při přípravě preparátů jsou často užívána barviva, která zakryjí pravou barvu vzorku; stále jsou ale zachovány různé odstíny a hloubky barev na místech s odlišnými chemickými a fyzikálními vlastnostmi
.

Osvětlovací aparát[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Osvětlovací aparát slouží k co nejdokonalejšímu osvětlení předmětové roviny (tedy roviny stolku, na kterém se nachází preparát). Hlavní funkcí je zajištění správného směru a intenzity světelných paprsků k adekvátnímu prosvícení preparátu (bez nežádoucích odlesků, tak, aby byly rysy a struktury preparátu co nejvíce zřetelné). Tato funkce je nejlépe splněna při uplatňování tzv. Köhlerova osvětlovacího principu, který bude popsán níže.

Osvětlovací aparát je obvykle tvořen:

  • zdrojem světla, obvykle halogenovou lampou o výkonu 50-100 W nebo xenonovou lampou o výkonu 75-150 W,
  • kolektorovou čočkou, která soustřeďuje světelné paprsky vycházející ze zdroje,
  • polní clonou, která je umístěna těsně za kolektorovou čočkou u zdroje světla a determinuje průměr sloupce světla jdoucího do kondenzoru; při polozavřené polní cloně uvidíme část obrazu s polovičním průměrem, při plně otevřené polní cloně uvidíme obraz téměř celý [3],
  • kondenzorem a kondenzorovou (aperturovou) clonou - kondenzor koncentruje světlo v souměrném kuželu směrem k preparátu; kondenzorová clona upravuje úhel paprsků při vrcholu kuželu: při zcela otevřené kondenzorové cloně je úhel paprsků větší, obraz mikroskopu ztrácí barevnou hloubku a kontrast, je světlejší a s lepším rozlišením; při zavřené kondenzorové cloně je úhel paprsků menší a obraz nabývá barevnou hloubku a kontrast, ale zároveň tmavne a stává se nezřetelným [4] - nejlepších výsledků je dosaženo, pokud je osvětleno pouze zorné pole objektivu.

Po usměrnění osvětlovacím aparátem prochází světlo nejdříve skrz pozorovaný preparát a dále skrz objektiv a okulár. Mezi jednotlivými složkami osvětlovacího aparátu mohou být položena šikmo postavená zrcadla, která paprsky světla směrují žádoucím směrem, neupravují ale tvar světelného válce/kužele.

Köhlerův osvětlovací princip[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Köhlerův osvětlovací princip je princip nastavení světelného aparátu tak, aby bylo dosaženo co nejlepších výsledků ve ztřetelnosti preparátu. Při uplatnění Köhlerova principu zobrazuje kondenzor polní clonu do předmětové roviny a kondenzorová clona umožňuje proudění světla pouze do zorného pole objektivu [5].

Objektivová optická soustava[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Objektiv je nejdůležitější součástí mikroskopu − kvalita objektivu determinuje výsledné zvětšení mikroskopu a výslednou kvalitu obrazu. Je také nejnáročnější na konstrukci. Obvykle obsahuje velké množství čoček různých tvarů a v různých skupinách (v tripletech, dubletech nebo samostatně) pevně umístěných v objektivovém tubusu. Rozložení, počet a tvar čoček je u každého typu objektivu individuální a výrazně ovlivňuje všechny parametry objektivu. Celá soustava čoček objektivu funguje dohromady jako spojná čočka. Objektiv produkuje skutečný, zvětšený a převrácený obraz.

Celkem rozlišujeme tři základní konstrukční typy objektivů: achromatický objektiv, fluoritový objektiv a nejkomplexnější apochromatický objektiv. Achromatický a fluoritový objektiv mají při stejné hodnotě zvětšení menší počet čoček a tím pádem výrazně horší korekci optických vad[6].

Schematický pohled na tři konstrukční typy mikroskopu (10x zvětšení): 1) přední čočka, 2) meniskoidní čočka, 3) diplety čoček, 4) triplet čoček.


Základní parametry objektivu [1][✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Tyto parametry se zásadně odvíjejí od konstrukce objektivu. V praxi jsou hodnoty pro konkrétní objektiv většinou napsány na boku těla (objímky) vlastního objektivu.

  • Numerická apertura objektivu, jež závisí na indexu lomu objektivu a aperturním úhlu (úhel paprsků při vrcholu kuželu světla vycházejícího z kondenzorové clony, viz Osvětlovací aparát) následujícím vztahem:
NA = n * sin (α),
kde je NA Numerická apertura, n Index lomu a α aperturní úhel; numerická apertura je přímo úměrná rozlišovací mezi mikroskopu, a je tedy jednou z nejzásadnějších charakteristik objektivů − snadno ji můžeme zvýšit použitím přední ploskovypouklé čočky při konstrukci mikroskopu (čímž zvýšíme aperturní úhel) a nebo přidáním imerzního oleje (čímž zvýšíme index lomu [7];
  • ohnisková vzdálenost objektivu, určená vzdáleností předmětového ohniska objektivu od předmětové hlavní roviny; ohnisková vzdálenost ovlivňuje zvětšení objektivu (a tím pádem i celkové zvětšení mikroskopu);
  • zvětšení objektivu (viz Zvětšení mikroskopu), které je určené ohniskovou vzdáleností objektivu, objektiv zajišťuje příčné zvětšení (další složkou celkového zvětšení mikroskopu je úhlové zvětšení mikroskopu, viz Okulárová optická soustava);
  • světelnost objektivu, která popisuje, jaký odpor klade objektiv procházejícímu světlu; je určena poměrem ohniskové vzdálenosti f k průměru kuželu světla vycházejícího z kondenzorové clony (viz Osvětlovací aparát); ideální světelnost objektivu je f:1, prakticky nejlepší světelnost objektivu se pohybuje okolo f:1,4 [8];
  • korekce optických vad.
Veličina Značka Jednotka Zásadní pro:
numerická apertura NA - rozlišovací mez mikroskopu (přímá úměrnost)
ohnisková vzdálenost objektivu f m [metr] příčné zvětšení objektivu
zvětšení objektivu Z - celkové zvětšení mikroskopu
světelnost objektivu k - zjištění optimální síly světla pro vytvoření zřetelného obrazu

Optické vady objektivu [9][✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Sférická aberace nastává, když se světelné paprsky procházející periferií čočky a středem čočky kříží v rozdílných bodech, čímž dochází k vzniku několika ohnisek; jedná se o jednu z nejzávadnějších poruch, která silně ovlivňuje rozlišení a kvalitu výsledného obrazu; pro korekci sférické aberace jsou využívány clony (které snižují počet paprsků dopadajících na periferii čočky) a přední a meniskoidní čočka objektivu, které mají minimální periferní oblast čočky;
  • chromatická aberace nastává vlivem rozdílného indexu lomu skla pro různé vlnové délky (jednotlivých barev spektra) − v závislosti na své vlnové délce vychází každý barevný paprsek pod odlišným úhlem a protíná se s paprskem stejné barvy v jiném bodě, dochází tedy podobně jako u sférické aberace ke vzniku několika ohnisek; výsledkem chromatické aberace je světelný bod "obkroužený" barvami spektra, což se prakticky projevuje jako obraz s množstvím barevných odlesků; korekce je prováděna pomocí použití dupletů a tripletů (rozdílně tvarovaných) čoček, u nichž k chromatické aberaci nedochází;
  • astigmatismus nastává, pokud není optická osa objektivu zcela kolmá na předmětovou rovinu mikroskopu, dochází k asymetrické projekci obrazu; astigmatismu je možné předcházet správnou konstrukcí mikroskopu;
  • koma nastává v podobném případě jako astigmatismus − jedná se o komplikovanější poruchu, kterou podporuje rozdílný úhel procházejících paprsků; dochází k asymetrické projekci obrazu (do tvaru komety − odtud "koma"); komě je možné předcházet správnou konstrukcí mikroskopu;
  • zkreslení nastává vlivem zakřiveného povrchu čočky; na obrazu se projevuje rozostřenými okraji při zaostřeném středu a naopak; při většině rutinní mikroskopové práce není na obtíž, pro účely mikroskopové fotografie se využívají tzv. plan objektivy s výrazně menším zakřivením čoček.

Okulárová optická soustava [10][✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Okuláry jsou poslední součástí mikroskopu, kterou prochází světelné paprsky ze zdroje světla. Podílejí se na finálních úpravách obrazu. Podobně jako objektivy se skládají z několika čoček, které dohromady fungují jako spojná čočka; počet čoček v okuláru je ale výrazně menší. Čočky okuláru souhrnně produkují zdánlivý, zvětšený a nepřevrácený obraz; celkový obraz produkovaný mikroskopem je tedy zdánlivý, zvětšený a převrácený.

Tok paprsků světla skrz optické soustavy mikroskopu.

Kromě čoček se v okulárech vyskytuje také okulárová clona. Podle polohy okulárové clony vůči čočkám rozlišujeme dva základní konstrukční typy okuláru: pozitivní okulár, ve kterém je clona umístěna před čočkami (nejblíže předmětové rovině) a negativní okulár, kde je clona obvykle umístěna za první čočkou. Nejjednodušší typ pozitivního okuláru se dvěma čočkami se nazývá Ramsdenův okulár; nejjednodušší typ negativního okuláru se nazývá Huygensův okulár.

Podobně jako u objektivů zde platí, že větší počet čoček zajistí lepší korekci optických vad; nejlepší korekci optických vad zajišťují tzv. plan okuláry.

Schéma základních konstrukčních typů okulárů: pozitivní (Ramsdenův) okulár, negativní (Huygensův) okulár.

Základní parametry okuláru[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Ohnisková vzdálenost okuláru, určena vzdáleností předmětového ohniska okuláru od jeho předmětové hlavní roviny; ohnisková vzdálenost určuje zvětšení okuláru;
  • zvětšení okuláru (viz Zvětšení mikroskopu), které je určeno ohniskovou vzdáleností okuláru; je zásadní pro určení celkového zvětšení mikroskopu, které je součinem příčného zvětšení objektivu a úhlového zvětšení okuláru;
  • korekce optických vad, která funguje na podobném principu jako u objektivu − okulár nemá schopnost korigovat optické vady vzniklé v objektivu (proto je zásadnější vlastnit kvalitní objektiv); vlastní optické vady okuláru jsou většinou odstraněny vytvořením stejné optické vady s opačným účinkem: např. chromatická aberace objektivu je eliminována použitím speciálního dubletu čoček, ve kterém první čočka propouští fialové světlo pod tupějším a druhá čočka pod ostřejším úhlem než červené světlo.

Při vybírání okuláru je zásadní vybrat takový okulár, který nejlépe odpovídá danému objektivu − zásadními faktory jsou zejména světelnost, ohnisková vzdálenost a numerická apertura objektivu.

Mechanická soustava[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Mechanická soustava optického mikroskopu: 1) stolek, 2) křížový posun, 3) makrošroub a mikrošroub, 4) revolver, 5) tubus, 6) zaostřovací kroužek, 7) očnice.

V praxi je mechanická soustava soustavou, se kterou přichází uživatel do styku nejvíce. Správně konstruovaná mechanická soustava je nutnou podmínkou kvalitního mikroskopu: zajišťuje pevné ukotvení čoček a clon, správný úhel světelných paprsků a předmětové roviny a velmi jemný vzájemný posun optických soustav a předmětové roviny ("ostření").

Součástmi mechanické soustavy jsou:

  • stolek s preparátem, kterým prochází předmětová rovina,
  • křížový posun, který umožňuje posunování preparátu v předmětové rovině (v praxi umožňuje přehlédnutí celého preparátu),
  • makrošroub a mikrošroub, které umožňují hrubé a jemnější posunování stolku nahoru a dolů - změnou vzdálenosti mezi předmětovou rovinou a objektivem umožňují zaostření na danou strukturu,
  • revolver, umožňující změnu objektivu (obvykle změnu objektivu na objektiv s rozdílným zvětšením) tak, aby vzdálenost předmětové roviny a objektivu zůstala zachována,
  • tubus, oddělující objektiv od okuláru, který zamezuje vniku nežádoucích světelných paprsků z vnějšího prostředí,
  • zaostřovací kroužek okuláru, který se vyskytuje, pouze pokud má mikroskop dva okuláry, jeden pro každé oko: v tom případě je zaostřovací kroužek umístěn pouze na jednom okuláru a umožňuje korekci rozdílu mezi vadou očí uživatele posunováním optické soustavy jednoho okuláru oproti optické soustavě objektivu,
  • gumová očnice okuláru, která slouží pro fixaci očí ve správné vzdálenosti od čoček okuláru.


Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Reference[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  1. a b c NAVRÁTIL, Leoš a Jozef ROSINA, et al. Medicínská biofyzika. 1 (dotisk 2013) vydání. Grada Publishing, 2005. 524 s. ISBN 978-80-247-1152-2.
  2. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/introduction.html
  3. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/fielddiaphragm/index.html
  4. http://www.microbehunter.com/the-condenser-aperture-diaphragm/
  5. http://web.natur.cuni.cz/~parazit/parpages/mikroskopickatechnika/svetelnamikroskopie.htm
  6. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/objectives.html
  7. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/numaperture.html
  8. http://www.photographybay.com/2010/01/02/photography-basics-lens-speed-and-aperture/
  9. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/aberrationhome.html
  10. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/oculars.html

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • NAVRÁTIL, Leoš a Jozef ROSINA, et al. Medicínská biofyzika. 1 (dotisk 2013) vydání. Grada Publishing, 2005. 524 s. ISBN 978-80-247-1152-2.
  •  LEPIL, Oldřich. Fyzika pro gymnázia :  mechanické kmitání a vlnění. 3. vydání. Praha : Prometheus, 2008. ISBN 978-80-7196-216-8.

Doporučená literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]