Metody analýzy nukleových kyselin

Z WikiSkript

Analýza nukleových kyselin je založena na dvou zásadních přístupech:

  • množení DNA: v živých organismech nebo in vitro chemickým procesem (PCR)
  • molekulární hybridizace

Aplikace:

  • analýza struktury genu, mapování, funkce
  • analýza geneticky podmíněných onemocnění
  • prenatální diagnostika
  • detekce nosičů mutovaných alel
  • diagnostika a patogeneze onemocnění
  • biosyntéza – insulin, růstový hormon,...
  • léčba genetických onemocnění – genová terapie
  • základní objev pro rozvoj

Selektivní namnožení specifických fragmentů DNA z genomové DNA nebo cDNA. Amplifikací je možné provádět in vivo nebo in vitro pomocí DNA-polymerasy

Množení uvnitř hostitelských buněk[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Díky objevení enzymů – restrikčních endonukleas – bylo umožněno získat různě dlouhé fragmenty, které mohou být dále analyzovány. Samotné množení je založeno na tvorbě rekombinantních molekul DNA, které vznikají spojením různých úseků molekul DNA pocházejících z taxonomicky odlišných druhů. Další důležitá DNA molekula nezbytná pro množení DNA, je tzv. vektor, do kterého je fragment DNA vložen. Rekombinovaný vektor je poté vnesen do hostitelského organismu, např. bakterie.

Restrikční endonukleasy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Restrikční endonukleasy jsou enzymy izolované z bakterií, které štěpí dvouvláknovou DNA ve specifických sekvencích. Enzymy chrání bakterie před vniknutím cizorodé DNA. Endonukleasy štěpí DNA tak, aby vznikaly přečnívající úseky tzv. kohezní nebo lepivé konce a fragmenty DNA, které mají definovanou délku. Většinou jde o palindromy.

Restrikční endonukleasy mohou štěpit rekombinantní molekuly DNA za účasti enzymu DNA-ligasy a komplementarity mezi lepivými konci, např. enzym EcoRI izolovaný z E. coli štěpí sekvenci GAATTC Restriktasy jsou třeba k získání dostatečného množství DNA.


Vektory[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Plasmidy - vyskytují se u bakterií
  • Lambda (λ) fág - patří mezi bakteriofágy
  • Kosmidy - kombinace DNA plasmidu a lambda fága
  • Umělé kvasinkové chromosomy - možnost klonovat velmi dlouhé fragmenty (až 2Mpb)
  • Bakteriální umělé chromozomy

Množení DNA in vitro - polymerasová řetězová reakce[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Polymerázová řetězová reakce, tzv. PCS, je mnohokrát opakovaná replikace DNA in vitro s tím, že každá replikovaná molekula DNA slouží jako templát: - denaturovaná DNA → nasednutí primeru → syntéza DNA.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce PCR.

Hybridizace nukleových kyselin[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Spočívá v denaturaci dvoušrobovice DNA a následné renaturaci. Může nastat mezi dvěma vlákny DNA, DNA a RNA, nebo RNA a RNA. Na základě hybridizace můžeme k detekci komplementární sekvence nukleové kyseliny použít sondu.

Southern blotting[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Základem je izolace a purifikace DNA, následné štěpení restrikčním enzymem za vzniku tisíců různě velkých fragmentů. Dalším krokem je elektroforetické rozdělení podle velikosti fragmentů. Poté je gel ponořen do alkalického roztoku, díky kterému se DNA denaturuje. Následuje blotting, což je přenesení denaturovaných fragmentů na membránu, která je vystavena teplotě 80 °C a fragmenty se na ní fixují. Pak nastává vlastní hybridizace.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Southern blotting.

Northern blotting[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Jedná se o podobnou techniku jako Southern blotting, ale analyzovanou kyselinou je RNA.

Technologie mikročipů[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

DNA mikročip je obvykle skleněná destička, na které jsou připojeny tisíce různých sekvencí DNA v určitém pořadí. Tyto molekuly slouží jako sondy k hybridizaci s testovacími vzorky. Využití technologie mikročipů:

  • Analýza genové exprese - srovnání exprese v buňkách a tkáních za různých situací (nádorové buňky)
  • Analýza genotypu - určení, zda je jedinec homozygot nebo heterozygot pro daný polymorfismus
  • Genetické testování - identifikace nosiče mutace, diagnostika dědičného onemocnění


Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Zdroj[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • KOHOUTOVÁ, Milada, et al. Lékařská biologie a genetika. (II. díl). 1. vydání. Praha : Karolinum, 2012. ISBN 978-80-246-1873-9.
  • ŠTEFÁNEK, Jiří. Medicína, nemoci, studium na 1. LF UK [online]. [cit. 11. 2. 2010]. <https://www.stefajir.cz/>.