Elektroforéza nukleových kyselin

Z WikiSkript

Úseky DNA, produkty PCR reakce nebo štěpy DNA můžeme v zásadě dělit chromatograficky nebo elektroforézou. Elektroforetické dělení je mnohem používanější. Provádí se zpravidla v gelu, a to buď agarosovém, nebo polyakrylamidovém. V obou případech se molekuly, které v zásaditém prostředí nesou záporný náboj, pohybují v elektrickém poli od katody k anodě. Gely tvoří poměrně hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly – mluvíme proto o technice molekulového síta.

Elektroforéza v agarosovém gelu[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Agarosa

Agarosa je polysacharid tvořený D-galaktosou a anhydro-L-galaktosou, který produkují některé mořské řasy a pod názvem agar se používá k výrobě gelů v potravinářství, mikrobiologii, imunologii či biochemii. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarosy. Čím je obsah polysacharidu vyšší, tím je lepší rozlišovací schopnost gelu, ale tím je také průběh elektroforézy pomalejší a příprava gelu je technicky náročnější.


Volba koncentrace agarosového gelu pro elektroforézu DNA
Obsah agarosy v gelu Délka DNA
0,5 % 1–30 kbp
0,7 % 0,8–12 kbp
1,0 % 0,5–10 kbp
1,2 % 0,4–7 kbp
1,5 % 0,2–3 kbp
2,0 % 50 bp–2 kbp
3–4 % 10 bp–1 kbp


Do agarosového gelu se většinou přímo přidává ethidiumbromid, takže po skončení elektroforézy lze jednotlivé frakce zobrazit UV zářením. Jinou možností detekce je blotting na membránu a následné obarvení nukleových kyselin nebo hybridizace se značenými sondami.


Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Polyakrylamid

Jiným nosičem používaným při elektroforéze nukleových kyselin je polyakrylamidový gel. Polymerací akrylamidu vznikají lineární molekuly polyakrylamidu. Ty se spojují příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘-methylenbisakrylamidem. Akrylamid i methylenbisakrylamid jsou poměrně stabilní látky; polymerace probíhá v nepřítomnosti vzdušného kyslíku (odstraní se odvzdušněním pomocí vakua) a zahajuje se přimíšením katalyzátorů peroxydisíranu amonného (známého pod starším názvem persíran amonný, krátce APS) a N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminu (TEMED).

TEMED

APS ve vodném roztoku s TEMED uvolňuje volné kyslíkové radikály, které atakují molekuly akrylamidu a bisakrylamidu a spouštějí tak jejich polymeraci.

Molekulové síto polyakrylamidového gelu je poměrně husté, hodí se proto pro rozdělování kratších fragmentů.

Volba koncentrace polyakrylamidového gelu pro dělení DNA
Polyakrylamid Délka DNA
3,5 % 1–2 kbp
5 % 75–500 bp
8 % 50–400 bp
12 % 35–250 bp
15 % 20–150 bp
20 % 5–100 bp


Díky tomu, že polyakrylamid je méně reaktivní než agarosa, lze fragmenty DNA kromě metod používaných v agarosovém gelu obarvit i dalšími technikami. Z klasických metod patří mezi nejcitlivější stříbření, kterým lze detekovat množství DNA i o několik řádů nižší než ethidiumbromidem.


Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]