Hybridizace in situ
Hybridizace in situ patří mezi molekulárně cytogenetická vyšetření. Jedná se o metodu, která umožňuje lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů v DNA, popř. RNA. Metoda využívá procesu denaturace a reasociace DNA. Pojem hybridizace znamená, že se podle pravidel komplementarity spojí vlákno vyšetřované DNA s druhým vláknem, kterým je sonda, která bývá označená. K hybridizaci dochází přímo ve vyšetřovaném biologickém materiálu, tedy na místě (in situ), nikoli na izolované DNA. Jako vyšetřovaný vzorek mohou být využity chromozomy z buněk v metafázi, interfázní jádra nebo celé buňky například z histologických řezů. Nejčastěji využívanou metodou hybridizace in situ je metoda FISH, při které se používají fluorescenčně značené sondy.
Princip[edit | edit source]
Vyšetřovaná nukleová kyselina nejprve musí být denaturována. Dojde k rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi a oddělení řetězců. Tímto způsobem získáme z původní dvoušroubovice DNA dva jednoduché polynukleotidové řetězce. Po navození reasociačních podmínek je na ně poté podle pravidel komplementarity bází navázán krátký a značený úsek nukleové kyseliny, tzv. sonda. Navázání sondy na vyšetřovanou DNA se projeví jako hybridizační signál, který můžeme pozorovat ve fluorescenčím mikroskopu.
Denaturace[edit | edit source]
Denaturaci neboli oddělení polynukleotidových řetězců lze vyvolat působením zvýšené teploty (94–96 °C), některými chemickými sloučeninami nebo specifickými enzymy. Teplota, při které je v roztoku denaturováno 50 % DNA, se nazývá teplota bodu tání (Tm) a závisí na mnoha faktorech:
- na podílu párů G–C,
- čím vyšší, tím vyšší je Tm,
- na koncentraci solí v roztoku (resp. na iontové síle),
- čím vyšší je koncentrace solí (resp. monovalentních kationtů – například Na+), tím je hodnota Tm vyšší,
- využívá se toho při odmývání nespecifických signálů (sníží se koncentrace monovalentních kationtů),
- na hodnotě pH roztoku,
- výrazně vyšší nebo výrazně nižší pH než 5–6 způsobí destabilizaci DNA,
- na přítomnosti denaturačních činidel v roztoku,
- např. formamidu, močoviny, hydroxidů apod.
Postup[edit | edit source]
- Příprava materiálu (kultivace, izolace jader, resp. chromozomů atd.)
- Denaturace sondy a cílové DNA – vysokou teplotou (společně nebo odděleně)
- Hybridizace sondy a cílové DNA – ochlazením (37 °C)
- Odstranění nespecifických signálů (stringent washing)
(Provádí se působením formamidu nebo roztoku o nízké iontové síle za současného zvýšení teploty a sonda se tak odstraní z míst, k nimž není zcela komplementární.) - Counterstaining (fluorescenční obarvení všech chromozomů, resp. jader)
- Vyhodnocení pod fluorescenčním mikroskopem s využitím specializovaného počítačového programu
Sondy[edit | edit source]
Sonda (próba) je uměle připravený, obvykle oligo- nebo polynukleotidový řetězec, který se naváže na cílovou DNA. Může jít o úsek DNA klonované pomocí vektorů nebo amplifikované pomocí PCR. Aby bylo možné pozorovat hybridizační signál, musí být sonda značená.
Značení sond[edit | edit source]
- Přímé značení:
- Umožňuje pozorovat hybridizační signál ihned po skončení hybridizace. Nevýhodou je, že signál nelze zesílit.
- K přímému značení se nejčastěji využívá:
- fluorescenční barvivo – fluorochrom (metoda FISH)
- radioaktivní izotop
- Nepřímé značení:
- Sonda je značena haptenem (látkou s antigenními vlastnostmi), který je následně detekován pomocí značené protilátky.
- Hybridizační signál je možné zesílit (amplifikovat).
- Je také možné protilátku konjugovat s enzymem, který katalyzuje vznik barevné reakce.
- Příkladem haptenu je biotin, který se detekuje pomocí avidinu konjugovaného s fluorochromem nebo enzymem.
Typy sond[edit | edit source]
- Satelitní sondy (telomerické nebo centromerické)
- Hybridizují s oblastmi obsahujícími satelitní sekvence.
- použití: vyšetření aneuploidií, identifikace původu marker chromosomů
- Lokus specifické sondy
- Hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA (jednotlivými geny, popř. skupinami genů).
- použití: vyšetření mikrodelecí u mikrodelečních syndromů a malignit a některých specifických translokací
- Malovací sondy (celochromozomové, parciální)
- Hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi, lze jimi označit celý chromosom.
- Nelze použít na interfázních jádrech.
- použití: vyšetření chromosomových přestaveb
Odkazy[edit | edit source]
Související články[edit | edit source]
Použitá literatura[edit | edit source]
- KOČÁREK, Eduard. Molekulární biologie v medicíně. 1. vydání. Brno : Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů v Brně, 2007. 218 s. ISBN 978-80-7013-450-4.
- KOČÁREK, Eduard a Martin PÁNEK. Klinická cytogenetika I : úvod do klinické cytogenetiky. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2010. ISBN 978-80-246-1880-7.
- MAŇÁKOVÁ, Eva a Alexandra SEICHERTOVÁ. Metody v histologii. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. ISBN 80-246-0230-X.