Hybridizace in situ

Z WikiSkript
Symbol kept vote.svg

Hybridizace in situ patří mezi molekulárně cytogenetická vyšetření. Jedná se o metodu, která umožňuje lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů v DNA, popř. RNA. Metoda využívá procesu denaturace a reasociace DNA. Pojem hybridizace znamená, že se podle pravidel komplementarity spojí vlákno vyšetřované DNA s druhým vláknem, kterým je sonda, která bývá označená. K hybridizaci dochází přímo ve vyšetřovaném biologickém materiálu, tedy na místě (in situ), nikoli na izolované DNA. Jako vyšetřovaný vzorek mohou být využity chromozomy z buněk v metafázi, interfázní jádra nebo celé buňky například z histologických řezů. Nejčastěji využívanou metodou hybridizace in situ je metoda FISH, při které se používají fluorescenčně značené sondy.

Princip[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Vyšetřovaná nukleová kyselina nejprve musí být denaturována. Dojde k rozrušení vodíkových můstků mezi bázemi a oddělení řetězců. Tímto způsobem získáme z původní dvoušroubovice DNA dva jednoduché polynukleotidové řetězce. Po navození reasociačních podmínek je na ně poté podle pravidel komplementarity bází navázán krátký a značený úsek nukleové kyseliny, tzv. sonda. Navázání sondy na vyšetřovanou DNA se projeví jako hybridizační signál, který můžeme pozorovat ve fluorescenčím mikroskopu.

Denaturace[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

FISH

Denaturaci neboli oddělení polynukleotidových řetězců lze vyvolat působením zvýšené teploty (94–96 °C), některými chemickými sloučeninami nebo specifickými enzymy. Teplota, při které je v roztoku denaturováno 50 % DNA, se nazývá teplota bodu tání (Tm) a závisí na mnoha faktorech:

  • na podílu párů G–C,
    • čím vyšší, tím vyšší je Tm,
  • na koncentraci solí v roztoku (resp. na iontové síle),
    • čím vyšší je koncentrace solí (resp. monovalentních kationtů – například Na+), tím je hodnota Tm vyšší,
    • využívá se toho při odmývání nespecifických signálů (sníží se koncentrace monovalentních kationtů),
  • na hodnotě pH roztoku,
    • výrazně vyšší nebo výrazně nižší pH než 5–6 způsobí destabilizaci DNA,
  • na přítomnosti denaturačních činidel v roztoku,
    • např. formamidu, močoviny, hydroxidů apod.

Postup[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  1. Příprava materiálu (kultivace, izolace jader, resp. chromozomů atd.)
  2. Denaturace sondy a cílové DNA – vysokou teplotou (společně nebo odděleně)
  3. Hybridizace sondy a cílové DNA – ochlazením (37 °C)
  4. Odstranění nespecifických signálů (stringent washing)
    (Provádí se působením formamidu nebo roztoku o nízké iontové síle za současného zvýšení teploty a sonda se tak odstraní z míst, k nimž není zcela komplementární.)
  5. Counterstaining (fluorescenční obarvení všech chromozomů, resp. jader)
  6. Vyhodnocení pod fluorescenčním mikroskopem s využitím specializovaného počítačového programu

Sondy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Sonda (próba) je uměle připravený, obvykle oligo- nebo polynukleotidový řetězec, který se naváže na cílovou DNA. Může jít o úsek DNA klonované pomocí vektorů nebo amplifikované pomocí PCR. Aby bylo možné pozorovat hybridizační signál, musí být sonda značená.

FISH lokus specifická sonda, M. Prader-Willi, delece 15q11-q13

Značení sond[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Přímé značení:
    • Umožňuje pozorovat hybridizační signál ihned po skončení hybridizace. Nevýhodou je, že signál nelze zesílit.
    • K přímému značení se nejčastěji využívá:
      • fluorescenční barvivo – fluorochrom (metoda FISH)
      • radioaktivní izotop
  • Nepřímé značení:
    • Sonda je značena haptenem (látkou s antigenními vlastnostmi), který je následně detekován pomocí značené protilátky.
    • Hybridizační signál je možné zesílit (amplifikovat).
    • Je také možné protilátku konjugovat s enzymem, který katalyzuje vznik barevné reakce.
    • Příkladem haptenu je biotin, který se detekuje pomocí avidinu konjugovaného s fluorochromem nebo enzymem.

Typy sond[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Satelitní sondy (telomerické nebo centromerické)
    • Hybridizují s oblastmi obsahujícími satelitní sekvence.
    • použití: vyšetření aneuploidií, identifikace původu marker chromosomů
  • Lokus specifické sondy
    • Hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA (jednotlivými geny, popř. skupinami genů).
    • použití: vyšetření mikrodelecí u mikrodelečních syndromů a malignit a některých specifických translokací
  • Malovací sondy (celochromozomové, parciální)
    • Hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi, lze jimi označit celý chromosom.
    • Nelze použít na interfázních jádrech.
    • použití: vyšetření chromosomových přestaveb

Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • KOČÁREK, Eduard. Molekulární biologie v medicíně. 1. vydání. Brno : Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů v Brně, 2007. 218 s. ISBN 978-80-7013-450-4.
  • KOČÁREK, Eduard a Martin PÁNEK. Klinická cytogenetika I :  úvod do klinické cytogenetiky. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2010. ISBN 978-80-246-1880-7.
  • MAŇÁKOVÁ, Eva a Alexandra SEICHERTOVÁ. Metody v histologii. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. ISBN 80-246-0230-X.