Identifikace chromozomů
Barvení chromosomů
Klasické barvení
Chromosomy obarvené roztokem podle Giemsy-Romanovského jsou homogenně tmavé. Tento typ barvení umožňuje hodnotit počet a hrubou stavbu chromosomů, zlomy a nestabilní přestavby (u jedinců vystavených působení klastogenních činitelů). Klasické barvení se používá i u pacientů s poruchami reparace poškozené DNA (Fanconiho anémie, ataxia-telangiectasia, Nijmegen-breakage syndrom).
G pruhy
G pruhování je nejčastěji rutinně používané barvení v cytogenetických laboratořích. Vzor tvořený příčnými pruhy se objeví na chromosomech inkubovaných v trypsinu po obarvení roztokem podle Giemsy-Romanovského. Počet pruhů závisí na stupni kondenzace chromosomů. V metafázi je na chromosomech 400–450 pruhů. V prometafázi je v karyotypu identifikovatelných okolo 850 pruhů. Tmavě se barví heterochromatinové oblasti tvořené DNA bohatou na adenin a thymin. Světlé pruhy odpovídají euchromatinu bohatému na guanin a cytosin.
R pruhy
Metoda R pruhování je založena na působení vysoké teploty (87 °C) a následném obarvení roztokem podle Giemsy-Romanovského. Výsledný pruhový vzor je reverzní k G pruhování (G negativní).
AgNOR barvení
Toto barvení se využívá ke sledování variant sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů. Dusičnan stříbrný se selektivně vysráží v oblasti nukleolárního organizátoru.
C barvení
Metoda slouží ke zobrazení konstitutivního heterochromatinu – satelitní DNA. U člověka je variabilita ve velikosti konstitutivního heterochromatinu na dlouhých ramenech chromosomů 1, 9, 16 a Y.
Speciální metody
SCE (Sister Chromatide Exchange)
Symetrická výměna úseků DNA mezi sesterskými chromatidami pozorovatelná na metafázních chromosomech. Za fyziologických podmínek dochází při každé replikaci ke 4–6 SCE. UV záření a působení genotoxických látek indukuje zvýšení počtu SCE v buňkách.
K vizualizaci SCE se využívá „harlequinská“ technika, založená na rozdílném zbarvení sesterských chromatid. Lymfocyty periferní krve se kultivují v mediu s BrdU (5-bromo 2-deoxyuridin – analog thyminu). Při replikaci se BrdU inkorporuje do nově vznikajících řetězců DNA namísto thyminu. V metafázi následujícího buněčného cyklu mají chromosomy v jedné sesterské chromatidě v obou vláknech DNA substituovaný BrdU a ve druhé chromatidě jedno vlákno původní a druhé s BrdU. Přítomnost BrdU v DNA snižuje její schopnost vázat některá barviva a po barvení např. Giemsovým barvivem jsou světlejší chromatidy s BrdU.
Podle zbarvení chromatid je v kultuře možné odlišit metafáze 1., 2. a 3. dělení.
Test SCE in vitro na lidských lymfocytech se využívá k testování klastogenních účinků látek. Tento test je citlivější než hodnocení ZCHA. In vivo způsobuje zvýšení počtu SCE např. kouření, a některá cytostatika (na bázi alkylačních látek). U jedinců s Bloomovým syndromem je vyšetření SCE rutinně používanou vyšetřovací metodou (počet výměn i více než 100 na mitózu).
Fragilní-X
V lidském karyotypu je známa řada fragilních míst – oblastí častého vzniku zlomů. Objevují se na metafázních chomosomech po expozici určitými látkami nebo při růstu v deficitních médiích. Většinou jejich přítomnost nesouvisí s patologickým fenotypem. Určitou výjimku tvoří fragilní místo Xq27.3 (FRAXA) u pacientů se syndromem fragilního X.
Xq27.3 je folát senzitivní místo, kreré je možno vizualizovat po kultivaci v mediu s nízkým obsahem kyseliny listové, příp. za přítomnosti antagonistů kys. listové FudR (5´-fluoro 2´-deoxyuridin) nebo metotrexátu.
Cytogeneticky lze za optimálních laboratorních podmínek (a při troše štěstí) diagnostikovat přítomnost fra Xq27.3 jak u postižených mužů tak u žen přenašeček.
Syndrom fragilního X je podmíněn expanzí tripletové repetice CGG v prvním exonu genu FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1). V současné době se pro diagnostiku FRAXA cytogenetická diagnostika již nevyužívá a dává se přednost přímé DNA diagnostice zaměřené na počet repetic v daném genu.
V oblasti Xq28 leží ještě další folát senzitivní fragilní místa; FRAXE – spojené s mírnější mentální retardací a snad benigní FRAXF.
Podrobnější informace naleznete na stránce Syndrom fragilního X.HRT (High Resolution Technique)
Metoda HRT umožňuje analyzovat velmi dlouhé jen částečně spiralizované chromosomy. Speciální kultivační technika zahrnuje synchronizaci dělení buněčné kultury methotrexátem a následné zastavení dělení v prometafázi. Na chromosomech je možné identifikovat až 850 G-pruhů. Tato metoda je vhodná pro analýzu strukturních přestaveb malého rozsahu (např. mikrodelecí), v rámci rutinní diagnostiky se s ní ovšem dnes již nesetkáme, neboť byla kompletně nahrazena (ještě přesnější) metodou microarray.
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
Metoda FISH využívá DNA sondy značené fluorescenčním barvivem k detekci specifických úseků DNA. FISH lze použít jako doplňkovou metodu při cytogenetickém vyšetření. Sondy se aplikují přímo na buněčný materiál (chromosomy v metafázi a prometafázi nebo interfázní jádra), není nutná izolace DNA. Preparáty se hodnotí pod fluorescenčním mikroskopem.
-
FISH – lokus specifická sonda, Prader-Willi -
FISH – lokus specifická sonda, delece 15q11-q13, Prader-Willi -
FISH – Schema lokus specifická sonda, Prader-Willi -
FISH – Malovací sonda t(5;7) -
Interfázní FISH – α-satelitní sonda, mozaika 46XX/45X
Typy sond
- Lokus-specifické sondy je možné použít pro jádra v interfázi i pro metafázní chromosomy. Slouží k vyšetřování mikrodelecí, subtelometrických přestaveb a amplifikací.
- Satelitní (centromerické, telometrické) sondy je možné použít pro jádra v interfázi i pro metafázní chromosomy. Užívají se k určení počtu jednotlivých chromosomů a k vyšetřování mozaicismu.
- Celochromosomové (malovací) sondy jsou vhodné pouze pro metafázní chromosomy. Slouží k hodnocení přestaveb chromosomů.
Nejčastěji používaná fluorescenční barviva
- DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol) – k podbarvení preparátů (counterstaining).
- FITC (fluorescein-5-isothiokyanát) – zelený signál.
- TRITC (tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát) – červený signál.
