Komparativní genomová hybridizace

Z WikiSkript
Symbol kept vote.svg

CGH (Comparative Genome Hybridization) je molekulárně cytogenetická metoda umožňující analýzu celého genomu v jediném experimentu. CGH vychází z principů metody FISH (Fluorescence in situ hybridization) a z tohoto pohledu ji je možné definovat jako “ kvantitativní, dvojbarevnou, obrácenou “ FISH. To vypovídá o omezení jejího použití na detekci kvantitativních (nebalancovaných) změn genomu (amplifikace/delece), k čemuž je použito 2 vzorků DNA značených dvěma rozdílnými fluorochromy. Jako sonda je tedy využita DNA izolovaná z vyšetřované tkáně.

Metoda[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Po izolaci 2 vzorků DNA jsou tyto vzorky nick-translací označeny dvěma rozdílnými fluorochromy. Jedním vzorkem je DNA odebraná z vyšetřované tkáně, která je standardně značena zeleným fluorochromem. Druhým vzorkem je kontrolní (referenční) DNA značená červeným fluorochromem. Tyto sondy jsou pak společně hybridizovány s normálními chromozomy. Výsledek hybridizace je pak snímán fluorescenčním mikroskopem, karyotypován a počítačově vyhodnocen.

Vyhodnocení[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

DNA vyšetřovaného jedince a referenční DNA v podstatě “kompetují“ o vazebná místa na chromozomech. V závislosti na tom, zda je určitý úsek vyšetřované DNA amplifikován, či deletován, pak ve výsledku v různých místech chromozomu převládá fluorochrom vyšetřované, nebo referenční DNA.

Počítačovou analýzou jsou získány hodnoty fluorescenčních intenzit vyšetřované a referenční DNA a je sestaven CGH profil v podobě křivky vyjadřující poměr intenzit obou fluorochromů v průběhu každého chromozomu.

Poměr intenzit fluorescence[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

= 1 → bez kvantitativní změny
< 0,75 → delece
> 1,25 → amplifikace, duplikace

Použití[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Metoda CGH nachází uplatnění především v onkocytogenetice při zjišťování nebalancovaných chromozomálních aberací u nádorů. Umožňuje identifikovat místa v genomu, kde došlo k delecím, nebo amplifikacím, a která tak mohou mít souvislost se vznikem či vývojem nádorového onemocnění.

Výhody[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Mezi pozitiva metody patří možnost celogenomového screeningu bez potřeby kultivace buněk.
  • Dále je to detekce aberantních míst bez předešlé znalosti jejich umístění v genomu.

Nevýhody[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Jako nedostatky metody pak můžeme považovat nemožnost odhalit aberace, které nedoprovází kvantitativní změna genetického materiálu.
  • Dále je limitující potřeba alespoň 50% zastoupení aberantních buněk ve vzorku.
  • Z principu metody také vyplývá, že nelze odlišit diploidní a tetraploidní tumory.
  • Limitující je pak i rozlišovací schopnost CGH, která činí 5–10 Mb.


Některé z těchto nedostatků řeší modifikace klasické metody CGH (viz dále)

Modifikace CGH[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

HR – CGH (High Resolution CGH)[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Tato metoda se od klasické CGH liší ve způsobu softwarového zpracování nasnímaného fluorescenčního obrazu. Je využito tzv. dynamických standardních referenčních intervalů namísto fixních. Východiskem dynamických referenčních intervalů je přirozená variabilita intenzit fluorescence každého chromozomového páru. Tyto hodnoty jsou zjištěny statistickým zpracováním odchylek kontrolních profilů u jedinců s normálním karyotypem.

Výhodou metody je rozlišení na úrovni 4–5 Mb a možnost odhalení aberací i při 20–30% klonálním zastoupení.

Array CGH[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Metoda využívá hybridizace fluorescenčně značených sond vyšetřované a referenční DNA s mnoha specifickými sekvencemi DNA namísto chromosomů, jak je tomu u klasické CGH. Každý z těchto malých úseků genomu má své přesné umístění v rámci mřížky, do které je rozčleněno podložní sklo (microarray, biočip) a mohou představovat jednotlivé geny či jejich části. Po hybridizaci s vyšetřovanou a referenční DNA je speciálním softwarem spočítán poměr fluorescence pro každý bod mřížky. Je tak možné analyzovat amplifikace nebo delece několika tisíc genů najednou, a to s rozlišovací schopností pod 100 kb. Tím se array CGH posouvá na úroveň molekulární diagnostiky.

Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Externí odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1.. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.