Konfokální mikroskop

Z WikiSkript
Fotografie konfokálního mikroskopu v zatemněné místnosti. Kontrastnější fotografii konfokálního mikroskopu naleznete například zde [1]

Konfokální mikroskop je druhem světelného mikroskopu.

Při pozorování reálného preparátu, jehož tloušťka není zanedbatelná (ideální preparát pro světelnou mikroskopii má tloušťku blížící se nule) je pozorování zkresleno paprsky vycházejícími z hmoty nad a pod zaostřenou rovinou. Tomuto nepříznivému efektu zabraňuje právě využití konfokálního mikroskopu. Mimo této výhody poskytuje konfokální mikroskop možnost rekonstruovat 3D modely preparátu.

Historie[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r. 1957. V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem (v odborné literatuře je znám pod názvem Tandem Scanning Confocal Microscope) byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání. Tandemový konfokální mikroskop se však v praxi příliš nerozšířil. Éra konfokální mikroskopie začíná až koncem sedmdesátých let, kdy byl zkonstruován první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem.

Princip[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Princip konfokálního mikroskopu

Zdrojem světla u konfokálního mikroskopu je laser (ultrafialové, infračervené nebo viditelné spektrum), který přes bodovou (konfokální) clonu a objektiv osvětluje preparát. Stejným objektivem poté prochází světlo odražené (případně emitované fluorescenční záření, pokud se jedná o fluorescenční konfokální mikroskopii). Paprsky prochází dichroickým zrcadlem a pokračují k bodové cloně, kde dochází k odfiltrování světla z jiných rovin. Nakonec paprsky vstupují do fotonásobiče, kde jsou zesíleny a detekovány.

Z uspořádání mikroskopu vyplývá, že v jednom kroku získáme informaci pouze o jednom bodu – pro získání obrazu celé roviny je nutné vytvořit serii snímků.

Podle mechanismu rastrování rozlišujeme:

  • konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem (CLSM, LSCM) – rastrování probíhá posouváním paprsku pomocí clony (umístěné mezi dichroické zrcadlo a objektiv) postupně do všech bodů roviny (podobný princip jako pohyb po stínítku televize), přibližná rychlost: 3 snímky/s
  • konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče – předchůdce rozmítaného laserového paprsku, rychlost až 60 snímků/s

Pokud je postupně nasnímáno dostatečné množství rovin, je možné pomocí počítače složit 3D model preparátu.

Využití[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Konfokální mikroskop je využíván při studiu povrchových vlastností materiálů, vyhodnocování testů tvrdosti kovů a plastických materiálů, měření výšky strukturních elementů na polovodičových čipech. V biologii se uplatňuje při studiu prostorových struktur buněk (např. cytoskeletu). S výhodou je možné konfokální mikroskopy použít při studiu architektury neuronových sítí v mozkové tkáni při jejím barvení pomocí Golgiho metody. Také je možné studovat intracelulární koncentrace iontů, měřit membránový potenciál a intracelulární pH. Při použití imunofluorescenčních metod je možné studovat např. rozložení receptorů v membránách. V cytologii a cytogenetice se konfokální mikroskop používá při studiu topologie buněčného jádra (vnitřní uspořádání chromatinu).

Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • NAVRÁTIL, Leoš a Josef ROSINA. Medicínská biofyzika. 1. vydání. Praha : Grada, 2005. 524 s. ISBN 80-247-1152-4.
  • KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.