Konfokální mikroskop

Fotografie konfokálního mikroskopu v zatemněné místnosti. Kontrastnější fotografii konfokálního mikroskopu naleznete například zde [1]

Konfokální mikroskop je druhem světelného mikroskopu.

Při pozorování reálného preparátu, jehož tloušťka není zanedbatelná (ideální preparát pro světelnou mikroskopii má tloušťku blížící se nule) je pozorování zkresleno paprsky vycházejícími z hmoty nad a pod zaostřenou rovinou. Tomuto nepříznivému efektu zabraňuje právě využití konfokálního mikroskopu. Mimo této výhody poskytuje konfokální mikroskop možnost rekonstruovat 3D modely preparátu.

Historie

Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r. 1957. V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem (v odborné literatuře je znám pod názvem Tandem Scanning Confocal Microscope) byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání. Tandemový konfokální mikroskop se však v praxi příliš nerozšířil. Éra konfokální mikroskopie začíná až koncem sedmdesátých let, kdy byl zkonstruován první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem.

Princip

Princip konfokálního mikroskopu

Zdrojem světla u konfokálního mikroskopu je laser (ultrafialové, infračervené nebo viditelné spektrum), který přes bodovou (konfokální) clonu a objektiv osvětluje preparát. Stejným objektivem poté prochází světlo odražené (případně emitované fluorescenční záření, pokud se jedná o fluorescenční konfokální mikroskopii). Paprsky prochází dichroickým zrcadlem a pokračují k bodové cloně, kde dochází k odfiltrování světla z jiných rovin. Nakonec paprsky vstupují do fotonásobiče, kde jsou zesíleny a detekovány.

Z uspořádání mikroskopu vyplývá, že v jednom kroku získáme informaci pouze o jednom bodu – pro získání obrazu celé roviny je nutné vytvořit serii snímků.

Podle mechanismu rastrování rozlišujeme:

• konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem (CLSM, LSCM) – rastrování probíhá posouváním paprsku pomocí clony (umístěné mezi dichroické zrcadlo a objektiv) postupně do všech bodů roviny (podobný princip jako pohyb po stínítku televize), přibližná rychlost: 3 snímky/s
• konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče – předchůdce rozmítaného laserového paprsku, rychlost až 60 snímků/s

Pokud je postupně nasnímáno dostatečné množství rovin, je možné pomocí počítače složit 3D model preparátu.

Využití

Konfokální mikroskop je využíván při studiu povrchových vlastností materiálů, vyhodnocování testů tvrdosti kovů a plastických materiálů, měření výšky strukturních elementů na polovodičových čipech. V biologii se uplatňuje při studiu prostorových struktur buněk (např. cytoskeletu). S výhodou je možné konfokální mikroskopy použít při studiu architektury neuronových sítí v mozkové tkáni při jejím barvení pomocí Golgiho metody. Také je možné studovat intracelulární koncentrace iontů, měřit membránový potenciál a intracelulární pH. Při použití imunofluorescenčních metod je možné studovat např. rozložení receptorů v membránách. V cytologii a cytogenetice se konfokální mikroskop používá při studiu topologie buněčného jádra (vnitřní uspořádání chromatinu).

Odkazy

• Optický mikroskop
• Elektronový mikroskop

Použitá literatura

• NAVRÁTIL, Leoš a Josef ROSINA. Medicínská biofyzika. 1. vydání. Praha : Grada, 2005. 524 s. ISBN 80-247-1152-4.

• KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 120 s. ISBN 80-246-1069-8.

• http://www.vesmir.cz/clanek/konfokalni-mikroskop
• Confocal microscopy