Stanovení počtu buněk, jejich viability a metabolické aktivity

Z WikiSkript

Řada postupů při práci s tkáňovými kulturami vyžaduje přesné stanovení počtu buněk ve vzorku. V praxi se běžně používají dvě metody přímého stanovení počtu buněk: ruční počítání v kalibrované komůrce pod světelným mikroskopem a poloautomatické počítání pomocí průtokového počítače částic.

Počítání buněk v komůrce[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Počítání buněk v komůrce je nejjednodušší a mnohdy i nejpřesnější metoda. U nás se obvykle používá Bürkerova komůrka. Na jednom mikroskopickém sklíčku jsou vybroušená dvě pole hluboká přesně 0,1 mm, na jejichž dně je síťovitý obrazec (vzdálenosti jednotlivých čar jsou uvedeny na obrázku).

Bürkerova komůrka – počítací pole a pohled z boku
Trypanová modř

Je-li třeba znát počet živých a mrtvých buněk ve vzorku, přidá se k buněčné suspenzi před počítáním barvivo, které neprochází intaktní buněčnou membránou, nebo je z intracelulárního prostoru aktivně transportováno ven. Nejčastěji se používá roztoku trypanové modři. Živé buňky zůstanou bezbarvé, zatímco mrtvé buňky, u nichž je porušena integrita buněčné membrány a jejích transportních mechanismů, se rychle zbarví na modro.

Použití průtokového počítače[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Při použití průtokového počítače částic lze přístroj doplnit dalšími čidly, která blíže určí charakter buněk. Nejčastěji se měří elektrické vlastnosti částic nebo se sleduje jejich interakce s laserovým paprskem. Tyto techniky se označují jako průtoková cytometrie a rutinně se používají v klinické biochemii a hematologii např. ke stanovení krevního obrazu, vyšetření kostní dřeně nebo močového sedimentu.

Používají se i další metody určení počtu buněk:

  • denzitometrie obarvené buněčné kultury (barviva užívaná v histologii, metylénová modř, Janusova zeleň);
  • stanovení DNA ve vzorku;
  • stanovení celkové bílkoviny ve vzorku.
  • stanovení aktivity některých enzymů (hexózaaminidáza).
MTT – oxidovaná forma
MTT – formazan (barevná forma)

Zvláštní postavení mezi těmito technikami zaujímá MTT test. MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) je mitochondriálními dehydrogenázami redukováno na barevný formazan. Rychlost tvorby formazanu odpovídá aktivitě dýchacího řetězce, a odráží tak metabolickou aktivitu buňky.