Metody sekvencování

Z WikiSkript

Před určováním sekvence nukleotidů se nukleová kyselina nejdříve rozštěpí endonukleázou na kratší řetězce (oligonukleotidy). Částečným naštěpením oligonukleotidu např. fosfodiesterázou z hadího jedu lze získat směs štěpů lišících se o jeden nukleotid na 3’-konci (např. z CCUAGCA vznikne směs obsahující CCUAGCA, CCUAGC, CCUAG, CCUA, CCU, CC). Jednotlivé tyto štěpy byly rozpoznány podle velikosti pomocí elektroforézy. V každé elektroforetické frakci bylo nutno zjistit zastoupení bazí. Tento postup byl principem první metody stanovení sekvence nukleotidů v RNA. Jeho zdlouhavost je zřejmá, popsaným způsobem bylo nutné analyzovat jednotlivé krátké oligonukleotidy, a ty pak seřadit na základě analýzy aspoň dvou lyzátů výchozí nukleové kyseliny získaných dvěma různými endonukleázami s odlišnou specifitou.

Maxam a Gilbert nalezli rychlejší postup, když ke zjišťování primární struktury nukleových kyselin (sekvencování) použili chemické štěpení polynukleotidu u jednoho ze čtyř nukleotidů (pomocí dimetylsulfátu lze štěpit u guaninového, pomocí piperidinu u cytosinového nukleotidu apod.). Oligonukleotid se nejdříve označí na 5’-konci radioaktivním P32 a jeho roztok se rozdělí na čtyři stejné vzorky. Každý vzorek se naštěpí přednostně u jednoho ze čtyř nukleotidů. Zvolené podmínky umožní většinou jedno štěpení v molekule. Takže např. v oligonukleotidu 5’-P32-TACGTCGA se získají čtyři různé směsi štěpů. Radioaktivní 5’-koncové štěpy jsou uvedeny v tabulce:

Počet nukleotidů
1.vzorek P32-TACGTCG 7
(štěpení k A) P32-T 1
2.vzorek P32-TACGTC 6
(štěpení ke G) P32-TAC 3
3.vzorek P32-TACGT 5
(štěpení k C) P32-TA 2
4.vzorek P32-TACG 4
(štěpení k T)

Tyto fragmenty se pak rozdělí polyakrylamidovou elektroforézou podle velikosti a frakce se detegují autoradiograficky nebo fluorescenčně. Sekvenci lze odečítat přímo z elektroforeogramu. Při hodnocení se postupuje od nejkratšího fragmentu a zaznamenává se typ lyzátu, ve kterém se štěp nachází (A, G, C nebo T). Moderní metody jsou upraveny pro analýzu DNA i RNA. Najednou lze vyhodnotit sekvenci i o délce několika set nukleotidů, elektroforeogramy jsou vyhodnocovány automaty a výsledky zpracovány počítačem.

Výsledek sekvenace úseku DNA automatickým sekvenátorem


Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Další kapitoly z knihy ŠTÍPEK, S.: Stručná biochemie uchování a exprese genetické informace:
Struktura nukleových kyselin: Základní složky nukleových kyselinPrimární struktura nukleových kyselinŘetězec nukleové kyseliny lze štěpit neenzymovou nebo enzymovou hydrolýzouMetody sekvencováníSekundární a vyšší struktura nukleových kyselin: Sekundární struktura DNADenaturace a reasociace řetězců nukleových kyselin, molekulární hybridizaceSekundární struktura RNATopologie DNA; • Interakce DNA s proteiny, struktura chromosomuBakteriální chromosomEukaryotické chromosomyDNA mitochondrií
Biosyntéza nukleových kyselin: Replikace DNATranskripce
Biosyntéza polypeptidového řetězce – translace: Transferové RNA (tRNA)Aktivace aminokyselin, syntéza aminoacyl-tRNAFunkce ribozómů v translaciTranslace u prokaryotůStruktura ribozómůIniciace translaceElongace peptidůTerminace translaceInhibitory bakteriální translaceTranslace u eukaryotůStruktura ribozómůIniciace eukaryotické translaceElongace eukaryotické translaceTerminace eukaryotické translaceInhibitory eukaryotické translace
Genetický kód
Biosyntéza nukleových kyselin a proteosyntéza v mitochondriích: Replikace mitochondriální DNAMitochondriální transkripceMitochondriální translace
Řízení genové exprese a proteosyntézy: Řízení genové exprese a proteosyntézy u prokaryotRegulace na úrovni transkripceRegulace sigma-faktoryJacobův-Monodův operonový modelRegulační význam cAMP u bakteriíVariace operonového řízení genůTryptofanový a arabinosový operonŘízení terminace transkripceRegulace bakteriální proteosyntézy na úrovni translaceŘízení genové exprese a proteosyntézy u eukaryotRegulace na úrovni uspořádání genůRegulace na úrovni transkripceRegulace posttranskripčních úprav pre-mRNARegulace na úrovni translaceŘízení rychlosti degradace mRNARegulace funkce proteinu kotranslačními a posttranslačními úpravami
Posttranslační úpravy a targeting proteinů: Signální sekvence polypeptidu, volné a vázané ribozómyPosttranslační glykosylace proteinůTargeting nezávislý na glykosylaci proteinůTargeting mitochondriálních proteinůTargeting jaderných proteinůRozhodovací mechanismus k destrukci nefunkčních proteinůReceptorem zprostředkovaná endocytóza
Biochemie virů: Reprodukce DNA virůReprodukce RNA virůInterferony
Biochemie genového inženýrství: Štěpení DNA na definovaném místě řetězceÚčinné dělení fragmentů DNA elektroforézouIdentifikace restrikčních fragmentůSyntéza umělé DNAPomnožení a exprese izolovaného nebo umělého genu v hostitelské buňce


Zdroje[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : Uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Medprint, 1998. 92 s. s. 13–14. ISBN 80-902036-2-0.