Přímá diagnostika dědičných chorob analýzou nukleových kyselin

Z WikiSkript

Umožňuje zachytit a identifikovat mutaci zodpovědnou za onemocnění u postižených a ve sledované rodině. Podmínkou je znalost lokalizace genu a znalost jeho standardní sekvence. Nabízejí možnost odhalení heterozygotního přenašeče mutované alely i u jedince, v jehož příbuzenstvu postižený jedinec není znám. Vyšetření začíná v úsecích genu s nejvyšším počtem mutací.

Metody, které zachytí jakoukoliv odchylku od standardní sekvence DNA[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Většina metod využívá k detekci PCR. U většiny genů nelze provést vyšetření v jedné reakci a to z důvodu jejich velikosti. Pomocí zvolených primerů jsou postupně amplifikovány jednotlivé úseky genu.

Analýza heteroduplexů[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Obecné schéma heteroduplexní analýzy

Založena na detekci chybného párování bazí (mismatch). K tomu dochází při hybridizaci komplementárního vlákna DNA standardního a mutantního typu, kdy vznikají hybridní molekuly DNA – heteroduplexy. Vytvářejí se v místech s delecemi nebo inzercemi několika bazí. Principem je rozdílná elektroforetická mobilita dsDNA v případě dokonalé a nedokonalé komplementarity.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Heteroduplexová analýza.

SSCP metoda[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Single Strand Conformation Polymorphism Analysis. Založena na analýze ssDNA (jednovláknová DNA), využívá PCR. Amplifikovaný úsek DNA je denaturován a nanesen na polyakrylový gel. Je-li ve vyšetřovaném úseku DNA přítomna mutace, jednovláknová DNA zaujme odlišnou konformaci (odlišná pohyblivost této DNA v gelu). Vlákna je možné vizualizovat – radioaktivní značení oligonukleotidů pro PCR.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce SSCP.

DGGE[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Průběh DGGE a CG svorka

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Vychází z rozdílného bodu tání v závislosti na složení dsDNA. Heteroduplexy a homoduplexy – migrují při elektroforéze gelem s lineárně se zvyšujícím množstvím denaturačních činidel. V místě, kde koncentrace denaturačních činidel odpovídá teplotě, při které dochází k částečné denaturaci DNA, se migrace parciálně denaturovaného úseku DNA značně zpomalí nebo zastaví. DNA heteroduplexy jsou méně stabilní a proto se jejich vlákna částečně separují dříve než vlákna homoduplexů – zpomalí svou mobilitu v gelu a migrují do jiné pozice.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce DGGE.

RT-PCR[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Výchozím materiálem je izolovaná RNA, která je konvertována do cDNA pomocí reverzní transkriptázy a amplifikovaná PCR. Poté je testována na přítomnost mutací. Umožňuje testovat větší úseky. Zachytí aberantní sestřih nebo aktivaci kryptického místa sestřihu, které jsou běžnými metodami velmi těžko identifikovatelné.

PTT[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Protein Truncation Test. Metoda specifická pro detekci mutací, které mají za následek vznik předčasného terminačního kodonu a tím zkrácení proteinového produktu. Z izolované mRNA je reverzní transkripcí a následnou PCR připravena cDNA, dále je provedena transkripce a translace in vitro. Velikost proteinového produktu testována elektroforeticky a srovnána s délkou standardního produktu. Používá se pro detekce frameshift a nonsense mutací.

Sekvenování[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Výsledek sekvenace úseku DNA automatickým sekvenátorem

Využití zejména v závěrečné fázi vyšetření. Odhalí odchylky v nukleotidové sekvenci DNA.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Sekvenování.

Chemické nebo enzymatické štěpení heteroduplexů[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Technika mismatch cleavage. Štěpení jednovláknového místa – tam, kde není úplná komplementarita obou vláken. Elektroforesa v denaturovaném gelu – průkaz přítomnosti štěpených nebo neštěpených fragmentů testované DNA.

Záchyt velkých delecí[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Delece postihující celý exon nebo gen nejsou běžnými metodami identifikovatelné. Lze je odhalit pomocí metod Southern blotting. V případě rozsáhlých delecí lze využít metoda FISH.

Real time PCR[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Zjištění přesného počtu kopií určitých sekvencí nukleové kyseliny v buňkách. Umožňuje monitorovat množství produktu DNA v každém cyklu PCR. Např. při zjištění hladiny virové infekce, počtu kopií onkogenu.

DNA čipy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Dvoukanálový DNA čip

Nejslibnější z moderních metod. Lze využít v kombinaci s počítačovým hodnocením výsledků.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce DNA čipy.

Metody detekce specifických mutací[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Lze je použít tam, kde má většina postižených v populaci jednu nebo omezený počet mutací Např. srpkovitá anémie, cystická fibróza.

Mutačně-specifická analýza RFLP[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

V případě, kdy mutace vytváří nebo ruší restrikční místo pro určitý restrikční enzym a zároveň je příčinou onemocnění. Metodou PCR dochází k amplifikaci úseku DNA s restrikčním místem. Následuje restrikce specifickými restrikčními enzymy a gelová elektroforéza.

ASO[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Alelově Spegifické Oligonikleotidy. Syntetizovány k detekci bodové nukleotidové diference v sekvenci DNA.

Diagnostika expanze trinukleotidů[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

DNA diagnostika v případě Huntingtonovy choroby. Amplifikace (PCR) v oblasti genu s vysokým obsahem repetic (CAG)n. Následuje elektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Počet repetic souvisí s rozvojem onemocnění. Při detekci Syndromu fragilního X je možné použít PCR pro detekci standartních nebo premutantních alel. Plné mutace jsou příliš dlouhé.

Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Zdroj[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • KOHOUTOVÁ, Milada. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2013. 202 s. ISBN 978-80-246-1873-9.