Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)/124. Otázka
 | 124. Otázka | |||
| Eukaryontní, prokaryontní translace. Regulace translace. | ||||
| Otázky z biochemie (1. LF UK, VL) | ||||
| ⏪️ ⏩️ | ||||
Translace u eukaryot
Struktura ribosomů
Cytoplazmatické ribosomy jaderných buněk jsou o něco větší než bakteriální (80S). Menší podjednotka (40S) obsahuje 18S rRNA a kolem 30 proteinů. Ve větší podjednotce (60S) se nachází 28S rRNA, 5.8S rRNA (někdy označovaná 7S), která je analogická bakteriální 5S rRNA. Na rozdíl od prokaryotické podjednotky 50S eukaryotická podjednotka 60S obsahuje ještě zvláštní 5S rRNA syntézovanou mimo jadérko za účasti RNA-polymerázy III. Všechny rRNA kromě 5S rRNA vznikají ze společného prekurzoru pre-45S rRNA, syntézovaného v jadérku pomocí RNA-polymerázy I. Podle živočišného druhu je ve velké podjednotce ještě 40 i více proteinů. Eukaryotické ribosomální proteiny se syntézují v cytoplazmě, pak jsou transportovány do jadérka, kde se navazují na syntézovanou pre-rRNA. Následuje zrání a transport ribosomálních podjednotek do cytoplazmy. Mitochondrie eukaryotických buněk mají vlastní proteosyntetický aparát včetně ribosomů.
Iniciace eukaryotické translace
Zahájení syntézy proteinu na cytoplazmatických ribosomech je o něco složitější než v bakteriích, vyžaduje více regulačních faktorů. Nejdříve se na čapku mRNA naváže CBP-protein (cap binding protein), který rozvine počáteční úsek mRNA, zpřístupní ho tak vazbě podjednotky 40S. Na 60S podjednotku navázaný iniciační faktor eIF6 (e…eukaryotický) zabraňuje reasociaci ribosomálních podjednotek. Iniciační Met.tRNAiMet není v jaderných buňkách formylována. Na menší podjednotku, spojen již s faktory eIF3 a eIF4C, přichází iniciační aa-tRNA v komplexu s GTP a eIF2. Vzniká podjednotkový komplex. Faktor eIF3 je významný pro následující vazbu tohoto komplexu na 5’-konec mRNA. Současně se hydrolyzuje ATP (nikoli GTP). Pak se podjednotkový komplex přemisťuje po mRNA k iniciačnímu kodonu AUG. Další faktor eIF5 musí uvolnit eIF2 a eIF3 z iniciačního komplexu. Pak teprve se může připojit větší ribosomální podjednotka (60S). Je k tomu třeba zmíněného eIF4C. Po vytvoření 80S ribosomu se všechny iniciační faktory uvolní a začne translace. Protein eIF2 má 3 podjednotky. γ-podjednotka váže Met-tRNAiMet. Faktor je aktivní jen tehdy, když jeho α-podjednotka váže GTP, které se při iniciaci translace hydrolyzuje. K regeneraci je třeba eIF2B zvaný též guanyl nucleotide exchange factor (GEF). Pro regulaci translace je významné, že α-podjednotka se za určitých okolností může fosforylovat, čímž se faktor inaktivuje.
Elongace eukaryotické translace
Tato fáze translace probíhá analogicky jako u prokaryot. Protein EF-1 má analogickou funkci jako prokaryotický EF-Tu, pomáhá navazovat aa-tRNA na místo A, a to ve své formě EF-1a.GTP. Po hydrolýze GTP na EF-1a.GDP se faktor regeneruje za účasti EF-1b. Následuje peptidyltransferázová reakce za vzniku peptidové vazby. K posunu mRNA po ribosomu (translokaci) je třeba faktoru EF-2.GTP (analog prokaryotického EF-G).
Terminace eukaryotické translace
Na rozdíl od prokaryotické terminace stačí k rozpoznání všech tří terminačních kodonů (UAA, UAG, UGA) pouze jediný faktor, eRF. Také v eukaryotických buňkách proteosyntéza probíhá na polysomech.
Inhibitory eukaryotické translace
Cykloheximid je toxická látka, která blokuje peptidyltransferázu na 60S podjednotce ribosomu. Používá se k výzkumným účelům. Původce záškrtu, Corynebacterium diphtheriae, uvolňuje proteinový toxin, který je smrtelný v mikrogramovém množství. Toxin katalyzuje přenos ADP-ribózy z NAD na jednu z aminokyselin EF-2 (kovalentní modifikace zvaná ADP-ribosylace). EF-2 je tak inaktivován. Tímto mechanismem jsou modifikovány i jiné G-proteiny.
Translace u prokaryot
Struktura ribosomů
Bakteriální ribosom byl první buněčnou organelou podrobně popsanou na molekulární úrovni. Ribosom E. coli je ribonukleoproteinová částice (70S, Mr = 2,5 milionu), skládající se z jedné menší (30S) a z jedné větší (50S) podjednotky. Menší podjednotka obsahuje jednu molekulu ribosomální RNA (16S rRNA) a 21 molekul proteinů, označovaných S1, S2,…S21 (angl. small=malý). Větší podjednotka (50S) se u bakterií skládá ze dvou rRNA (23S a 5S) a 34 proteinů (angl. large = velký, proto L1, L2,…L34). Většina proteinů je v částici zastoupena jednou molekulou. Složky ribosomálních podjednotek jsou uspořádány tak, aby organela mohla plnit vazebné, katalytické a regulační funkce a aby mohla měnit konformaci a posunovat molekulu mRNA. Větší podjednotka tvarem připomíná křeslo, menší je oválná.
Iniciace translace
Syntéza peptidového řetězce je u bakterií zahajována vytvořením iniciačního komplexu, skládajícího se z podjednotky 30S, mRNA a iniciační aa–tRNA, což u bakterií je N–formylmethionyl–tRNA (fMet–tRNAiMet). Tato aa–tRNA se váže na mRNA s iniciačním kodonem AUG (někdy též GUG, čteným jako signál pro Met). Na mRNA byl objeven úsek před iniciačním kodonem (Shineova–Dalgarnova sekvence), který je komplemetární k 3’–konci 16S rRNA. Asociace mRNA s 16S rRNA přispívá ke správné lokalizaci mRNA na ribosomu.
Iniciační komplex se tvoří tak, že na podjednotku 30S se nejdříve navážou proteinové iniciační faktory IF1, IF2 a IF3. Připojení GTP k IF2 umožní vazbu tohoto komplexu s mRNA a iniciační Met–tRNA. Vznikne iniciační komplex 30S.IF3.mRNA.IF1.IF2.fMet–tRNA.GTP. K němu se pak naváže ribosomální podjednotka 50S. Současně se uvolní faktory IF1, IF2, IF3 a hydrolyzuje se GTP na GDP a fosfát.
fMet–tRNAiMet obsadí na ribosomu tzv. peptidylové místo P. Další, aminokyselinové místo A, je určeno k vazbě další aa–tRNA, odpovídající kodonu následujícímu za AUG.
Methionin je formylován transformylasou za účasti N10–formyltetrahydrolistové kyseliny a to až po navázání aminokyseliny na iniciační tRNAf Met–tRNAm, zařazující methionin dovnitř peptidového řetězce, je poznávána též kodonem AUG, při translaci se váže na aminokyselinové místo ribosomu a není formylována. Popsaná modifikace iniciační Met–tRNA není známa u eukaryot.
Elongace peptidu
Prodlužování syntézovaného peptidu probíhá ve třech krocích:
1.fáze: Navázání další aa–tRNA na aminoacylové místo ribosomu. Tato aminoacyl–tRNA je vybrána kodonem nacházejícím se v tomto místě. Na ribosom je dopravena v komplexu s proteinovým elongačním faktorem EF–Tu, vázajícím GTP. Při předání aa–tRNA se GTP hydrolyzuje a EF–Tu se uvolní z ribosomu. Na EF–Tu.GDP se připojí elongační faktor EF–Ts a změní konformaci komplexu natolik, že se GDP uvolní. Regenerovaný EF–Tu může po vazbě s novým GTP vstoupit do dalšího cyklu. EF–Tu nereaguje s f–Met–tRNAiMet. Proto se tato aa–tRNA nenavazuje na aminoacylové místo. EF–Tu však váže Met–tRNA a zajišťuje tak zařazení methioninu dovnitř řetězce.
Při hydrolýze GTP a uvolňování EF–Tu–GDP z ribosomu se konformace faktoru mění v blízkosti právě navázané aa–tRNA natolik, že jen aa–tRNA pevně a přesně vázaná na antikodon a aminoacylové místo se neuvolní. Pokud je omylem zařazena nesprávná aa–tRNA se slabšími vazbami, je v této fázi translace opět uvolněna. Faktor EF–Tu udává rychlost (krok) celé translaci.
Protein EF–Tu patří do velké a fylogeneticky staré rodiny proteinů G, které jsou mimo jiné součástí mechanismu hormonální regulace.
2.fáze: Tvorba peptidové vazby (transpeptidace). Vznik peptidové vazby je katalyzován peptidyltransferasou, která je součástí podjednotky 50S. V podstatě jde o nukleofilní ataku skupiny dusíku 2–NH2 skupiny připojované aminokyseliny (aa–tRNA na místě A) na karboxylový uhlík f–Met–tRNAiMet nebo peptidyl–tRNA, nacházející se na místě P. Mezi zúčastněnými aminokyselinami se vytvoří peptidová vazba a zároveň se rozštěpí esterová vazba mezi aminokyselinou a tRNA na místě P. Na místě A tak vznikne peptidyl–tRNA. Jinak řečeno, peptidyl se přenese z předchozí tRNA na skupinu NH2 následující aa–tRNA, čímž se řetězec prodlouží o jednu aminokyselinu. Z toho vyplývá, že peptidový řetězec roste od N–konce k C–konci.
3.fáze: Translokace je pochod, při kterém se volná tRNA z peptidylového místa uvolní a mRNA se posune o 3 nukleotidy (o jeden kodon), takže peptidyl–tRNA se dostane z místa A na místo P. K posunu je třeba elongační faktor EF–G s navázaným GTP, který patří mezi zmíněné proteiny G jako EF–Tu. Hydrolýzou GTP se EF–G z ribosomu uvolní. Na volné místo A se může navázat další aa–tRNA a cyklus se opakuje. Tímto způsobem se mRNA posunuje po ribosomu, z něhož se zároveň odvíjí rostoucí polypeptidový řetězec.
Terminace translace
Ribosom se během syntézy polypeptidu posune k terminátoru, tj. kodonu, signalizujícímu ukončení translace. Je to kodon UAG,UAA nebo UGA. Žádný z nich nekóduje zařazení nějaké aminokyseliny do peptidu, tyto kodony rozpozná některý z proteinových uvolňovacích terminačních faktorů (releasing factors). Faktor RF1 pozná UAA a UAG, RF2 pak UGA a UAA. Po navázání faktoru na ribosom se peptidyl–tRNA přesune z místa A na místo P. Specifita peptidyltransferasy se změní natolik, že přepojí peptidyl na molekulu vody místo na 2–NH2 další aa–tRNA. Jinak řečeno, hotový peptid se hydrolyticky uvolní od poslední tRNA. Uvolní se tRNA a mRNA a ribosom se rozpadne na podjednotky 50S a 30S. Iniciační faktor IF3 se ihned naváže na 30S a tak zabrání reasociaci ribosomu, který by byl nefunkční, neboť neobsahuje mRNA. Jednotlivé složky se mohou účastnit tvorby nového iniciačního komplexu a zahájit nový cyklus. Na jediné mRNA je simultánně navázáno několik ribosomů, které po řetězci mRNA postupují v určitém odstupu a na každém z nich probíhá syntéza jednoho peptidu. Celý útvar se nazývá polyribosom, též polysom. Tímto způsobem se mRNA využívá velmi efektivně.
Inhibitory bakteriální translace
Řada antibiotik používaných v lékařské praxi i pro výzkumné účely inhibuje některou fázi translace.
Streptomycin brání v navázání fMet–tRNAiMet na 30S–podjednotku ribosomu a znemožňuje zahájení translace. Kromě toho je příčinou chybného čtení genetického kódu.
Tetracyklin se též navazuje na podjednotku 30S a inhibuje připojení aa–tRNA na místě A. Běžně užívaný chloramfenikol inhibuje bakteriální peptidyltransferasu (toxický cykloheximid působí analogickým způsobem na eukaryotickou translaci). Erytromycin zastavuje translaci tím, že se připojuje na podjednotku 50S. Uvedená antibiotika se užívají k léčení bateriálních infekcí, zatímco puromycin je s úspěchem používán k vědeckým účelům, ke studiu mechanismu proteosyntézy. Svou strukturou imituje 3'–konec tyrosinyl–tRNA. Methyltyrosinyl je v puromycinu vázán pevnou amidickou, nikoli esterovou vazbou a molekula nemá antikodon. Na místě A se rostoucí peptid přenese na puromycin a výsledný peptidyl–puromycin se z ribosomu uvolní. Syntéza peptidu je tak předčasně přerušena.
