Izolace DNA

Z WikiSkript
DNA icon.svg

Začíná-li molekulárně-genetické vyšetření polymerázovou řetězovou reakcí, stačí někdy jako vzorek velmi malé množství DNA. Někdy lze dokonce použít přímo část tkáně nebo několik buněk lyzovaných např. tenzidy nebo zmrazováním a rozmrazováním. Kvalita templátové DNA nicméně ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat ať už tím, že působí jako inhibitory polymerázy, nebo tím, že se váží na templátovou DNA a znepřístupňují ji tak polymerasové reakci. Bývá proto výhodné DNA ze vzorku izolovat.

Metody izolace[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Pro izolaci DNA se používá řada postupů. Částečka tkáně, nebo např. leukocyty izolované z periferní krve, se zpravidla nejprve lyzuje pomocí tenzidů a pak se DNA očistí od bílkovin a dalších kontaminujících látek. Může se tak dít chemicky (např. hydrolýzou bílkovin pomocí proteolytických enzymů, jejich denaturací apod.) i fyzikálně (na základě různé afinity DNA a kontaminantů k různým látkám). V současnosti se nejčastěji používají dvě metody:


  • Izolace DNA vazbou na silikátovou kolonku. Využívá se vysoké afinity DNA k silikagelové náplni v chromatografické kolonce. DNA se v přítomnosti vysoké koncentrace solí naváže na silikát, zatímco kontaminující látky kolonkou protečou. DNA se pak vymyje např. destilovanou vodou nebo zředěným pufrem.
  • Izolace DNA fenol-chloroformovou metodou. Jde o „zlatý standard“, který se i přes jistou pracnost a nepohodlnost (práce s toxickými a zapáchajícími látkami) stále používá, neboť je spolehlivý, levný a poskytuje velmi čistou DNA.


Fenol-chloroformová metoda izolace DNA[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Prvním krokem je homogenizace tkáně v pufru, který obsahuje tenzid (např. dodecylsíran sodný, SDS). Přídavek tenzidu rozpustí buněčné membrány. Rozpad buněk se usnadňuje přídavkem proteinázy K. Tento účinný bakteriální enzym, který má teplotní optimum kolem 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ionty a který neinhibují ani koncentrované tensidy, zároveň částečně hydrolyzuje kontaminující bílkoviny. Navíc velmi účinně štěpí DNázy, které by izolovanou DNA mohly rozštěpit.
  • Následuje denaturace bílkovin a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu. Fenol-chloroformová směs se nemísí s vodou. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracovávání vzorků bohatých na proteiny. Protože i stopové zbytky fenolu by mohly inhibovat polymerasovou reakci, přečistí se nakonec vzorek protřepáním se samotným chloroformem.
  • Poté se DNA vysráží z vodného roztoku. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování). Pak se ke směsi přidá málo polární látka (např. etanol nebo izopropanol); snížení polarity rozpouštědla vede k precipitaci DNA.
  • Vysrážená DNA se promývá v 70% etanolu. Alkohol v této koncentraci rozpustí zbytky solí a bílkovin, samotná DNA však zůstane nerozpuštěná.
  • Izolovaná a přečištěná DNA se zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA). Tato komplexotvorná látka jednak usnadní rozpuštění DNA, jednak vychytáním Ca2+ působí jako inhibitor DNáz a vzorek tak stabilizuje.