Mutageneze
Úvod[edit | edit source]
Mutageneze nebo též genotoxicita je proces, při němž dochází působením mutagenních faktorů (mutagenů) k poškození DNA. Tento pojem bývá často spojován s karcinogenezí (též kancerogenezí), což je proces, při němž dochází vlivem karcinogenů k poškození DNA s následkem přeměny normální buňky v buňku nádorovou. Tyto pojmy nelze bezvýhradně zaměňovat. Platí zde, že každý karcinogen je mutagenem, ne však u každého mutagenu byla prokázána karcinogenní aktivita. Tento článek by měl přispět k pochopení základních principů mutageneze, dává stručný přehled základních typů mutagenů a základních typů testování genotoxicity. Zaměřen je obecně, prakticky, vždy jsou uvedeny jen některé nejběžnější a modelové příklady. Proto je určen pregraduálním studentům medicíny i laické veřejnosti.
Mutagenní faktory[edit | edit source]
Mutagenní faktory jsou různorodou skupinou.
1. Dle jejich povahy a podstaty je dělíme na mutageny fyzikální, chemické a biologické.
- Chemické mutageny způsobují mutace na základě chemické modifikace nukleotidu (zejména bází) a změnami polynukleotidového řetězce (štěpení, vmezeření atd.). Pro představu uvádíme pár příkladů. Alkylační, arylační látky (yperit, benzo(a)pyren) vytváří tzv. adukty s bázemi nukleových kyselin. Dále jsou to tzv. interkalátory – např. fluorescenční barviva nebo další chemické látky způsobující deaminace, hydroxylace, štěpení vazeb v DNA, RNA. Různé syntetické analogy bází po svém zařazení způsobují hlavně substituční mutace, protože se během replikace chybně párují s komplementárními bazemi. Typickými zástupci z běžného života jsou různá potravinářská barviva, produkty spalování (tedy kouření a automobilové zplodiny) a PCB – složky umělých hmot.
- Fyzikálními mutageny jsou zejména ionizační a UV záření. Působením UV záření vznikají mutace při replikaci – mezi nejčastější patří pyrimidinové dimery. Před tímto zářením jsme chráněni kožními orgány, kde se tyto mutace shromažďují. Při nadměrném vystavení UV světlu nebo při poruchách replikačních reparačních mechanizmů může mít vysoké nahromadění mutací karcinogenní účinek a vznikají rakoviny kůže. Jedna z nejznámějších geneticky podmíněných poruch, kdy jsou poškozeny právě i reparace thyminových dimerů vzniklých po UV záření, je xeroderma pigmentosum.
- Biologickými mutageny jsou biologicky aktivní částice jako například viry (DNA, RNA, retro) a transpozony (Line,Alu,Sine).
2. Mutageny dělíme dále z hlediska biochemického, dle mechanizmu působení, na přímé a promutagenní látky.
- Přímé mutageny jsou faktory schopné svou vlastní podstatou a složením vyvolat nějaké změny v DNA.
- Promutageny jsou samy o sobě neškodné, mutagenními se stanou až po metabolické aktivaci, která umožňuje jejich zpracování organismem.
Testy genotoxicity[edit | edit source]
Abychom zjistili, které látky a faktory jsou v jaké míře mutagenní a člověku nebezpečné, provádí se tzv. testy mutagenity nebo genotoxicity. Základní laboratorní testování se provádí na třech úrovních – molekulární, genové a chromozomové.
- Testy na molekulární úrovni zjišťují změny na úrovni DNA například následujícími mechanismy:
- stanovení aduktů, imunohistochemickými metodami zjišťujeme míru přítomnosti aduktů v testovacím vzorku DNA;
- pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) a jiných molekulárně-biologických metod zjišťujeme vznik konkrétních mutací;
- tzv. neplánovaná syntéza DNA (UDS) je založena na měření míry reparačních mechanismů (reparačních syntéz) úměrné poškození DNA cestou inkorporace radioaktivně značeného nukleotidu;
- nejznámější tzv. „kometový test“ (comet assay) nebo SSGE (single cell electrophoresis) využívá toho, že vlivem mutagenních účinků vznikají v jádrech buněk fragmenty. Jejich množství je úměrné míře genotoxicity působícího testovaného potenciálního mutagenu na buňku. Jádra buněk převádíme do gelu a pomocí elektroforézy se uvolňují vzniklé fragmenty. Po obarvení jader fluorescenčním barvivem a pozorování přes fluorescenční mikroskop pozorujeme útvar podobající se letící kometě, jejíž tělo odpovídá jádru a velikost (délka a rozsah) ohonu odpovídá množství fragmentů DNA, a tedy i míře genotoxicity.
- Testy na úrovni genové zjišťují rozsáhlejší poškození celých genů. Genové mutace jsou zjistitelné následujícími biochemickými metodami:
- SOS/umu test měří podobně jako u neplánované syntézy DNA úroveň reparačních mechanizmů, které budou probíhat na látce, jež byla vystavena mutagenu, nyní jde ale o opravy v rámci celých genů. Využívají se zde speciální kmeny bakterií a sleduje se míra exprese mutátorových genů (tedy genů jejichž produkty se podílejí zásadně v reparačních procesech).
- indukcí rezistentních mutant u savčích buněk in vitro, kdy můžeme působením mutagenů indukovat vznik mutant, které budou rezistentní k určitým normálně toxickým chemickým látkám jako např. vůči ouabainu, 6-thioguaninu, 8-azaguaninu atd...
- Amesův test, jeden z nejpoužívanějších testů genotoxicity, umožňuje sledovat reverzní mutace u histidin-deficientních kmenů bakterie Salmonella typhimurium. Tyto kmeny přežijí pouze v médiu obsahujícím histidin. Působením mutagenů u těchto bakterií dojde k reverzní mutaci, která zpětně opraví poškozený gen a tím bakterie získají znovu schopnost tvorby histidinu, kterou předtím postrádaly. Množství žijících bakterií na mediu bez histidinu odpovídá síle a množství mutagenu.Test se provádí na třech Petriho miskách s mutantními kmeny bakterií v mediu chudém na histidin. Miska, do které nebyl přidán mutagen, slouží jako negativní kontrola a objevuje se zde jen malé množství adaptovaných životaschopných bakterií – tzv. spontánní revertanti. Do druhé misky se navíc přidává testovaná látky (potenciální mutagen) a prokázání mutagenity koresponduje s velkým množstvím životaschopných revertantů. Třetí miska slouží jako pozitivní kontrola a místo testované látky přidáváme navíc již známý mutagen, jehož účinek je stejný jako v předchozím případě.
- Testy na úrovni chromozomové odhalují množství změn v rámci chromozomových aberací, ať už velkého, či submikroskopického rozsahu. Většinou se jedná o poškození více genů, genových skupin vlivem strukturní nebo numerické aberace vzniklé jako následek mutagenního působení. Mezi tři nejpoužívanější metody patří:
- Testování pomocí detekce a stanovení frekvence strukturních a numerických chromozomových aberací u savčích buněk v kultuře, na laboratorních zvířatech nebo u osob, které přišly do styku s testovaným mutagenem. Tímto způsoben probíhá např. monitoring pracovníků rizikových pracovišť. U každé osoby se zde např. pomocí karyotipizace, CGH nebo čipových metod (array CGH) dá zjistit množství aberací v jednotlivých buňkách. Mutagenitu dále hodnotíme dle hodnoty frekvence buněk s velkým množstvím aberací, přičemž frekvenci do 2 % považujeme za normální nález, hodnoty 2–4 % jsou hraniční a nález nad 4 % je považován za výsledek působení mutagenu. Je nutno podotknout, že při takto prováděném testování dojdeme k objektivnímu výsledku, pokud testujeme dostatečný počet osob (cca 20), nejlépe s 50 % zastoupení mužů a žen.
- Další možností je testování výměny sesterských chromatid (SCE – Sister Chromatid Exchanges). Sledujeme míru – frekvenci výměn sesterských chromatid, která roste u buněk vystavených mutagenu. K detekci můžeme využít barvení malovacími sondami M-FISH nebo metodu SKY, kdy nabarvené chromozomy pozorujeme pod fluorescenčním mikroskopem a výsledky jsou zpracovány a zaznamenány počítačem.
- Mikronucleus test neboli „test tvorby mikrojader“ je založen na faktu, že působením mutagenů dochází k tvorbě chromozomových fragmentů bez centromer. Tyto acentrické chromozomy nejsou během mitózy zavzaty do jádra a v cytoplazmě vytváří tzv. mikrojádra. Míra výskytu mikrojader nás tedy také, jako testy předešlé, informuje o tom, má-li látka mutagenní účinek a o síle mutagenu.
Odkazy[edit | edit source]
Externí odkazy[edit | edit source]
- [1], kurz lékařské biologie II.
Související články[edit | edit source]
Zdroje[edit | edit source]
- KOČÁREK, Eduard a Martin PÁNEK. Praktická cvičení z klinické cytogenetiky : pracovní sešit ke skriptům Klinická cytogenetika I. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2006. 54 s. s. 47-52. ISBN 80-246-1070-1.
- KOČÁREK, Eduard, Martin PÁNEK a Drahuše NOVOTNÁ, et al. Klinická cytogenetika I : Úvod do klinické cytogenetiky,vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 2. vydání. Praha : Karolinum, 2010. 134 s. ISBN 978-80-246-1880-7.
- GOETZ, Pavel, et al. Vybrané kapitoly z lékařské biologie, díl 2. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2002. 139 s. ISBN 80-246-0320-9.
--Luciehronova 21. 2. 2012, 13:20 (CET)