Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)/127. Otázka

127. Otázka
Restrikční enzymy a další nástroje genového inženýrství, konstrukce rekombinantních molekul DNA a proteinů. Klonování DNA.
Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)
⏪️   ⏩️


Restriktázy

[ upravit vložený článek ]


Příklad palindromní sekvence DNA (modře) a štěpení lepivých konců (červeně).

Restrikční endonukleázy (zkráceně restriktázy) jsou velká skupina původně bakteriálních enzymů, které štěpí esterové vazby v řetězci dsDNA. Bakteriím pravděpodobně slouží jako ochrana před narušením jejich genomu cizí (např. virovou) DNA.

Klasifikace

Restrikční endonukleázy se dělí do čtyř skupin podle specifity štěpení, struktury a dalších vlastností. V některé literatuře jsou rozlišovány pouze tři typy.

Typ I

Endonukleázy prvního typu mají podjednotkovou strukturu (molekula obsahuje tři různé podjednotky), jsou schopné methylace DNA a štěpí pouze nemethylovaný řetězec. I když na molekule rozlišují specifické sekvence, místo štěpení není přesně určeno.

Typ II

Díky specificitě štěpení má tento typ největší uplatnění v genovém inženýrství, molekulu nemethylované DNA štěpí v místě (nebo v blízkosti) rozpoznávací sekvence, která je obvykle symetrická. Molekula je složená ze dvou totožných podjednotek.

Typ III

Endonukleázy zařazované do této skupiny jsou složeny ze dvou podjednotek. Nemethylovanou DNA štěpí ve vzdálenosti 25–27 dp od rozpoznávacího místa.

Typ IV

Štěpí methylovanou DNA.

Využití

Restriktázy mají velký význam, především v genovém inženýrství, výzkumu a soudním lékařství (identifikace osob). Informace o jednotlivých restrikčních endonkleázách, mikroorganismech, ze kterých byly izolovány, cílových sekvencích apod. shromažďuje REBASE (The Restriction Enzyme Database).

Genové manipulace a genové inženýrství

[ upravit vložený článek ]
  • genetické inženýrství cíleně konstruuje buňky, resp. organismy, o takových kombinacích genů v genomech, které v přírodě neexistují. Otevírají se tak nové přístupy pro hlubší analýzu genomů samostatných a současně zcela nové možnosti v biotechnologických procesech
  • genetické inženýrství pracuje hlavně s bakteriemi a kvasinkami, a to dvěma hlavními experimentálními přístupy – genovým a buněčným inženýrstvím
  • genové inženýrství (genové manipulace)
    • je možné vytvořit zcela nové molekuly DNA
    • konstrukce chimerických molekul DNA in vitro z fragmentů DNA izolovaných buněk zcela odlišných druhů, rodů, čeledí a dokonce říší
    • jde o kombinaci jejich genů do souvislých nukleotidových sekvencí
  • klonováním DNA můžeme získat vzácné buněčné proteiny ve velkém množství; pro tvorbu proteinů byly zkonstruovány tzv. expresivní vektory – obsahují vhodné regulační sekvence a promotor v těsné blízkosti místa, do kterého je vklonován insert s kódující sekvencí; promotor spolu s regulačními sekvencemi zajišťuje produkci velkého množství mRNA, která může být překládána uvnitř buňky
  • klonováním DNA lze vybrat jednu konkrétní sekvenci z milionu dalších a vytvořit nekonečné množství jejich kopií
  • fragmenty DNA mohou být spojeny in vitro pomocí DNA-ligázy a dát tak vznik molekule DNA, která se v přírodě nevyskytuje
  • prvním krokem při klonování je inzerce požadovaného fragmentu do molekuly DNA, která je schopná replikace – např. plasmid nebo virový genom; vytvořená rekombinantní molekula DNA je pak vložena do rychle se dělící hostitelské buňky – např. bakterie, a při každém buněčném dělení dochází i k její replikaci
  • sada klonovaných fragmentů, které reprezentují kompletní genom organismu = genomová knihovna – je často udržována ve formě bakteriálních klonů, kdy každý klon nese jiný klonovaný fragment DNA
  • klonované geny mohou být pomocí technik genového inženýrství trvale začleněny do genomu buňky nebo organismu

Význam genového inženýrství

  • umožnilo poznání úplných a přesných sekvencí řady eukaryotních genů, vč. regulačních sekvencí
  • výrazně doplnilo konstrukci fylogenetických „stromů“ živočišných a rostlinných druhů
  • genové manipulace zahájily současně novou éru biotechnologií, umožnily výrobu nové generace vakcín (proti hepatitidě A i B, proti chřipce, slintavce, atd.)
  • genové „doplněné“ bakterie, resp. kvasinky, dnes produkují lidské hormony: inzulin, somatostatin, somatotropin a řadu mozkových hormonů (enkefalinů a endorfinů)
  • z bakterií s rekombinovanou DNA lze získat také mimořádně čisté AMK, enzymy, alkaloidy, steroidy, giberilliny a další biologicky aktivní látky v prakticky neomezených množstvích
  • v medicíně se perspektivně může uplatnit genová terapie dědičných chorob