Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)/128. Otázka
 | 128. Otázka | |||
| Metody frakcionace buňky, elektroforéza nukleových kyselin a proteinů. | ||||
| Otázky z biochemie (1. LF UK, VL) | ||||
| ⏪️ ⏩️ | ||||
Frakcionace buněk
Frakcionace buňky je metoda pro získání částí buňky schopných samostatné funkce. Používá se pro oddělení organel a makromolekul pro následnou analýzu jejich složení a funkcí. Jednotlivé makromolekuly mohou být poté dále izolovány a analyzovány, např. pro určení proteinové poruchy. Postup frakcionizace se skládá ze dvou částí: homogenizace buňky a purifikace složek.
Homogenizace buněk
Homogenizace buněk je proces při kterém dojde k rozrušení membrány buňky a uvolnění buněčných součástí do roztoku. Můžeme jí dosáhnout několika metodami. Orientačně se rozdělují mezi hrubé a jemné metody. Jemné metody jsou používané například pro buněčné kultury. Oproti tomu hrubé metody jsou používané pro pevnější struktury, které vyžadují určitou míru mechanického poškození, jako například pojivová nebo kožní tkáň.
Hrubé metody
- Kuličková homogenizace
- Při této metodě využíváme drobné kovové nebo skleněné kuličky, které se v určitém poměru smísí s buňkami. Následným mícháním nebo třepáním dojde nárazy kuliček k rozdrcení membrán. Metoda je velice jemná, ale bohužel časově náročná.
- Ultrazvuk
- Opakovanými ultrazvukovými rázy dochází k rozdrcení membrán. Nevýhodou této metody je, že generuje vysoké množství tepla, které může poškodit funkci součástí buňky a tím celý postup znehodnotit. Pro izolaci proteinů se proto využívá zmrazený preparát.
- Vysoký tlak
- Při této metodě jsou buňky drceny vysokým tlakem. Příkladem pro to může být protlačování buněk úzkým otvorem při průchodu kterým buňky prasknou. Využít k tomu můžeme například French press.
- Jemné rozmixování
- Zmrzlá tkáňová kultura může být rozmixována jemným mixérem, přičemž dojde k mechanickému rozbití buněčné stěny a membrány. Případně můžeme zmrzlý vzorek mechanicky rozemlít.
Jemné metody
- Opakované zmražování a tání
- Metoda efektivní zejména pro živočišné buňky. Buňky se opakovaně zmrazují (např. tekutým dusíkem) a nechávají roztát. Jelikož led má větší objem než voda, prorazí při zmražení krystalky ledu buněčné membrány a uvolní jejich obsah.
- Enzymatické rozrušení
- S použitím enzymů specifických pro každou buněčnou kulturu dojde k natrávení složek buněčné membrány, případně stěny. Často se využívá v kombinaci s jinými metodami. Většinou využívaná pro bakterie, kvasinky, fungi, algae i živočišné buňky.
- Detergent
- S pomocí detergentu dojde k rozpuštění buněčné membrány. Opět se častu využívá ve spojení s jinými metodami, aby se dosáhlo požadovaného účinku. Vhodné pro živočišné buňky.
- Osmotická lýza
- V prostředí hypotonického roztoku buňka nasaje vodu, nabobtná a eventuálně dojde k jejímu prasknutí, čím se uvolní její obsah do okolí. Opět vhodná metoda pro živočišné buňky, které nemají buněčnou stěnu.
Purifikace složek
Hrubou filtrací (např. přes gázu) můžeme oddělit nehomogenizované buňky od zbytku. Pro pustupné oddělení složek se používá převážně centrifugace a ultracentrifugace. Na základě odlišné velikosti a objemu jednotlivých organel a makromolekul probíhá sedimentace v centrifugách odlišnou rychlostí. Díky extrémnímu gravitačnímu přetížení sedimentují i jednotlivé makromolekuly.
Nejprve sedimentují velké složky jako třeba buněčná jádra. Při vyšších rychlostech mitochondrie, poté zlomky endoplasmatického retikula. Při vyšších rychlostech a delším čase centrifugace se usadí malé váčky, poté ribozomy a menší částečky. Všechny tyto frakce nejsou neprve čisté, ale oddělením usazeniny, jejím resuspendovaním a opětovnou centrifugací je možné je purifikovat. Většinou je však nutné celý proces opakovat několikrát.
Elektroforéza nukleových kyselin
Úseky DNA, produkty PCR reakce nebo štěpy DNA můžeme v zásadě dělit chromatograficky nebo elektroforézou. Elektroforetické dělení je mnohem používanější. Provádí se zpravidla v gelu, a to buď agarosovém, nebo polyakrylamidovém. V obou případech se molekuly, které v zásaditém prostředí nesou záporný náboj, pohybují v elektrickém poli od katody k anodě. Gely tvoří poměrně hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly – mluvíme proto o technice molekulového síta.
Elektroforéza v agarosovém gelu
Agarosa je polysacharid tvořený D-galaktosou a anhydro-L-galaktosou, který produkují některé mořské řasy a pod názvem agar se používá k výrobě gelů v potravinářství, mikrobiologii, imunologii či biochemii. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarosy. Čím je obsah polysacharidu vyšší, tím je lepší rozlišovací schopnost gelu, ale tím je také průběh elektroforézy pomalejší a příprava gelu je technicky náročnější.
| Obsah agarosy v gelu | Délka DNA |
|---|---|
| 0,5 % | 1–30 kbp |
| 0,7 % | 0,8–12 kbp |
| 1,0 % | 0,5–10 kbp |
| 1,2 % | 0,4–7 kbp |
| 1,5 % | 0,2–3 kbp |
| 2,0 % | 50 bp–2 kbp |
| 3–4 % | 10 bp–1 kbp |
Do agarosového gelu se většinou přímo přidává ethidiumbromid, takže po skončení elektroforézy lze jednotlivé frakce zobrazit UV zářením. Jinou možností detekce je blotting na membránu a následné obarvení nukleových kyselin nebo hybridizace se značenými sondami.
Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu
Jiným nosičem používaným při elektroforéze nukleových kyselin je polyakrylamidový gel. Polymerací akrylamidu vznikají lineární molekuly polyakrylamidu. Ty se spojují příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘-methylenbisakrylamidem. Akrylamid i methylenbisakrylamid jsou poměrně stabilní látky; polymerace probíhá v nepřítomnosti vzdušného kyslíku (odstraní se odvzdušněním pomocí vakua) a zahajuje se přimíšením katalyzátorů peroxydisíranu amonného (známého pod starším názvem persíran amonný, krátce APS) a N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminu (TEMED).
APS ve vodném roztoku s TEMED uvolňuje volné kyslíkové radikály, které atakují molekuly akrylamidu a bisakrylamidu a spouštějí tak jejich polymeraci.
Molekulové síto polyakrylamidového gelu je poměrně husté, hodí se proto pro rozdělování kratších fragmentů.
| Polyakrylamid | Délka DNA |
|---|---|
| 3,5 % | 1–2 kbp |
| 5 % | 75–500 bp |
| 8 % | 50–400 bp |
| 12 % | 35–250 bp |
| 15 % | 20–150 bp |
| 20 % | 5–100 bp |
Díky tomu, že polyakrylamid je méně reaktivní než agarosa, lze fragmenty DNA kromě metod používaných v agarosovém gelu obarvit i dalšími technikami. Z klasických metod patří mezi nejcitlivější stříbření, kterým lze detekovat množství DNA i o několik řádů nižší než ethidiumbromidem.
Elektroforéza bílkovin v séru
Princip elektroforézy sérových bílkovin
Podrobnější informace naleznete na stránce Elektroforéza.Elektroforéza (ELFO) je založena na pohybu nabitých částic v elektrickém poli. Stanovované látky musí mít charakter iontů nebo amfolytů. Bílkoviny patří mezi amfolyty, které mohou nabývat kladného i záporného náboje v závislosti na pH pufru, při kterém elektroforéza probíhá. Je-li směs nabitých částic vystavena působení elektrického pole, začnou se molekuly látek pohybovat. Pohyblivost bílkovin je ovlivněna těmito faktory:
- charakterem dělené látky (velikost náboje, tvar a velikost molekul, relativní molekulová hmotnost);
- vlastnostmi prostředí, ve kterém dělení probíhá (hodnota pH, iontová síla, napětí, proud).
Pozitivně nabité molekuly proteinů se lépe adsorbují než negativně nabité molekuly, a proto při elektroforéze proteinů jsou využívány negativní náboje. Izoelektrický bod většiny sérových bílkovin je v oblasti slabě kyselé při pH 5–6. Proto v prostředí alkalického pufru, nejčastěji pH 8,6, budou u sérových bílkovin převažovat záporné náboje a jejich pohyb bude s různou rychlostí směřovat k anodě. Albumin vykazuje nejvyšší negativní náboj a tím i nejrychlejší pohyblivost k anodě.
Elektroforéza může probíhat na různých nosičích. Historicky nejstarším byl chromatografický papír. V klinicko-biochemické praxi se nejčastěji setkáváme s elektroforézou na acetátcelulózových foliích nebo na agarózovém gelu. Při elektroforéze, která využívá jako nosič papír nebo acetátcelulózu, putují molekuly bílkovin roztokem pufru, který je vně nosiče. Molekuly se tedy dělí především podle svého náboje. Podobně se budou dělit bílkoviny i v málo koncentrovaném agarózovém gelu.
Pomocí elektroforézy se bílkoviny krevního séra rozdělí obvykle na 5–6 frakcí – albuminovou, α1, α2, β, γ frakce se někdy rozliší na β1 a β2. S výjimkou albuminů jsou další frakce tvořeny vždy skupinou bílkovin, které mají přibližně stejnou elektroforetickou pohyblivost.
Provedení
Kapka séra je přidána na sklíčko s elektroforetickým agorózovým gelem a rozprostřena po „startovní čáře“, kolmo na směr budoucího elektrického pole. Poté je vystavena účinkům elektrického pole v elektroforetické vaně. Vlivem elektrického pole začínají proteiny migrovat v agarózovém gelu.
Po uplynutí určité doby (např. 30 minut při napětí 120 V) se bílkoviny v gelu denaturují („fixují“), zpravidla působením alkoholů (metanolu) a kyselin (kyseliny octové). Tím se zabrání jejich difuzi nebo vymytí z gelu v dalších krocích. Poté se bílkoviny obarví vhodným organickým barvivem (např. amidočerní). Poloha jednotlivých frakcí a koncentrace bílkovin v nich se poté hodnotí pomocí denzitometrie.
- Více informací o elektroforéze formou on-line videa najdete např. na stránkách Masarykovy Univerzity.
Hodnocení elektroforézy sérových bílkovin
| Název frakce | Hodnoty v relativních % | Hodnoty v g/l |
|---|---|---|
| Albumin | 55–69 | 35–44 |
| α1 | 1,5–4 | 1–3 |
| α2 | 8–13 | 5–8 |
| β | 7–15 | 4–10 |
| γ | 9–18 | 5–12 |
Charakteristika jednotlivých frakcí
- Zóna prealbuminu
V této oblasti se pohybuje prealbumin (transtyretin), jehož zóna je však velmi diskrétní a těžko hodnotitelná.
- Zóna albuminu
Albumin vytváří poměrně širokou a z obou stran dobře ohraničenou zónu. Při poklesu koncentrace albuminu pod 30 g/l je patrné její oslabení. Vzácně pozorované zdvojení frakce je projevem genetické strukturní odchylky albuminu u heterozygotů – bisalbuminemie nebo vzniká při navázání cizorodé substance na albumin, např. penicilinu.
- Interzóna mezi albuminem a α1-globuliny
Slabé homogenní zbarvení této oblasti je podmíněno α1-lipoproteiny. Podobnou elektroforetickou pohyblivost vykazuje také α1-kyselý glykoprotein, ale zabarvení zóny ovlivňuje minimálně.
- Zóna α1-globulinů
Zónu α1-globulinů ovlivňuje především α1-antitrypsin. Při akutních zánětech je zřetelné zesílení. Klinicky významná je genetická variabilita α1-antitrypsinu, která se v elektroforéze může často zřetelně projevit oslabením, někdy až vymizením jeho zóny se současnou změnou pohyblivosti.
- Interzóna mezi α1 a α2-globuliny
Obvykle je celá slabě homogenně zbarvená.
- Zóna α2-globulinů
Na vytváření této zóny se podílejí především dvě bílkoviny – α2-makroglobulin a haptoglobin. Změny koncentrace α2-makroglobulinu nemají velký diagnostický význam. Haptoglobin vytváří 6 fenotypů, které se liší elektroforetickou pohyblivostí. Elektroforetické vyšetření neumožňuje rozlišení fenotypů haptoglobinu.
- Interzóna mezi α2 a β1-globuliny
Normálně se barví pouze slabě. Při hemolýze vznikají komplexy hemoglobin-haptoglobin, které v této oblasti vytvářejí samostatnou zónu.
- Zóna β1-globulinů
Tvar a intenzita zbarvení zóny β1-globulinů je ovlivněna prakticky pouze transferinem. Intenzita zóny dobře koreluje s celkovou vazebnou kapacitou plazmy pro železo. Při anemii z nedostatku železa a v těhotenství se zvyšuje syntéza transferinu a intenzita zóny se zesílí. Další protein s β1-elektroforetickou pohyblivostí, hemopexin, se špatně barví používanými barvivy a změny v jeho koncentraci se v elektroforéze neprojeví.
- Interzóna mezi β1 a β2-globuliny
V této oblasti nalézáme imunoglobulin IgA, který podmiňuje homogenní zbarvení zóny. Dále zde vytváří typickou linii β-lipoprotein, jejíž přítomnost závisí na jeho koncentraci.
- Zóna β2-globulinů
Na vytváření zóny β2-globulinů se podílí C3 složka komplementu. Podle intenzity zbarvení se dá těžko odhadnout koncentrace C3.
- Zóna γ-globulinů
Charakter zóny γ-globulinů je ovlivněn koncentracemi čtyř podtříd imunoglobulinu IgG. Zvýšení IgG se projeví intenzivnějším zbarvením a rozšířením zóny v obou směrech. Imunoglobulin IgM leží blíže startu. Samostatné nebo současné zvýšení koncentrace IgM pomocí elektroforézy nerozpoznáme.
Klinické využití
Elektroforéza sérových bílkovin (ELFO) se provádí zejména, zjistíme-li patologický výsledek celkové bílkoviny, nebo potřebujeme-li podrobnější informaci o sérových bílkovinách. Zvlášť cenné je pro průkaz:
- dysproteinemie – změna koncentrace a kvalitativního složení jednotlivých bílkovin v séru,
- paraproteinemie – charakterizována přítomností monoklonálních imunoglobulinů.
ELFO u některých patologických stavů
| Typ elektroforeogramu | Komentář | Alb | α1 | α2 | β | γ | Výskyt (příklad) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Akutní zánět |
|
|
| ||||
| ↓ nebo N | ↑ | ↑ | N | ||||
| Chronický zánět |
|
|
| ||||
| ↓ nebo N | N | N | N | ↑ | |||
| Chronický aktivní zánět |
|
|
| ||||
| ↓ | ↑ | ↑ | N | ↑ | |||
| Hepatální typ |
|
|
| ||||
| ↓ | ↓ | ↓ | ↓ | ↑ | |||
| Nefrotický typ |
|
|
| ||||
| ↓ | N | ↑ | ↑ | ↓ nebo N | |||
| Hypogamaglobulinemie |
|
|
| ||||
| N | N | N | N | ↓ | |||
| Monoklonální gamapatie |
|
|
| ||||
| ↓ | ↓ | ↓ | ↑ | ↑ | |||
