In vitro kultivace

Kultivace buňky v Petriho misce

In vitro kultivace je pěstování mikroorganismů na půdách v umělých, laboratorních podmínkách.

• Kultivace – pěstování mikroorganismů na umělých půdách k tomu určených. Při kultivaci dojde k pomnožení zárodků, což umožňuje určení jejich druhu. Kultivace je součástí mikrobiologického vyšetření moči, krve, hlenu, hnisu, tekutiny z výpotků, stěru z kůže a podobně.

• In vitro– latinsky „ve skle“, tedy ve zkumavce, za umělých či laboratorních podmínek. Například při testech účinků chemických látek na živý organismus jsou účinky zkoumány nejprve na kultuře buněk pěstovaných ve zkumavce. Jiným příkladem je oplodnění in vitro – „dítě ze zkumavky“.

In vitro

Termín in vitro v překladu z latiny znamená „ve skle“. Tato metoda se používá v biologii, medicíně a dalších příbuzných oborech a je založena na pěstování buněčných (popř. tkáňových) kultur mimo organismus, ze kterého pochází. K vývoji této metody velkou měrou přispěl francouzský lékař, laureát Nobelovy ceny, Alexis Carrel (1873-1944), jehož pokusy probíhaly na začátku 20. století.

Kultivace buněk in vitro

Aby kultivace byla úspěšná, je zapotřebí odebranou tkáň či soubor buněk co nejrychleji přenést do živného roztoku nebo média. Toto médium se svým chemickým složením a fyzikálními vlastnostmi snaží co nejvíce přiblížit přirozenému prostředí v těle (in vivo), tedy tělním tekutinám (lymfě, krevní plazmě, mozkomíšnímu moku atd.) Musí se přísně kontrolovat koncentrace solí a organických živin, hodnota pH, teplota prostředí, ve kterém se vzorek vyvíjí, a mnoho dalších faktorů. Velký důraz se musí klást na sterilitu používaných nástrojů, aby nedošlo k infikaci dané kultury.

Nezbytnou součástí živného média je sérum (fetální bovinní sérum), které iniciuje buňky k dělení a tedy i růst celé kultury. Další součástí tohoto média jsou antibiotika, aby se předcházelo infekci a tedy i zániku celé kultury.

V případě úspěšné kultivace se nám buňky začínají množit a vzniká buněčná (resp. tkáňová) kultura. Tyto kultury se pěstují zpravidla na Petriho miskách v termostatu při stálé teplotě 37 °C. Po určité době se ovšem živné médium vyčerpá a je nutné část buněk odebrat a přenést do jiné kultivační nádobky s čerstvým živným roztokem. Tento proces se nazývá pasážování buněk a je nutné ho pravidelně opakovat.

Růstová křivka buněčné kultury

Růstová křivka buněčné kultury.

Lag-fáze

Počet buněk v médiu nejprve lehce poklesne, což je způsobeno adaptací na kultivační prostředí. Po tomto úvodním „šoku“ začíná ovšem velikost populace rapidně růst.

Log-fáze

V log-fázi (logaritmické resp. exponenciální fázi) roste počet buněk v kultuře exponenciálně a je možné zachytit vysoké procento buněk v mitóze. Toho lze využít pro karyotypizaci).

Stacionární fáze

Buňky v kultuře se přestávají množit. To je způsobeno inhibičními mechanismy (např. kontaktní inhibice) a částečně také vyčerpáním živného média.

Fáze úbytku buněk

Dochází k ní z důvodu nedostatku živin, snížení pH (díky zvýšení CO2), kumulace toxických produktů metabolismu atd.

Druhy kultur živočišných buněk

Primokultury (primární kultury)

Jedná se o buňky či tkáně čerstvě odebrané z organismu. Z celé populace vložené do živného média přežívá jen ta část, která se nejlépe přizpůsobí novým podmínkám. Buňky, které se přizpůsobily se začínají dělit. Tato kultura existuje zpravila jen pár dní, protože poté se musí pasážovat.

Buněčné kmeny

Jedná se o buněčnou kulturu normálních diploidních buněk, které minimálně jedenkrát již prošly procesem pasážování. Tyto kmeny zpravidla zanikají po 40-50ti děleních z důvodu zkracování telomer.

Buněčné linie (permanentní buněčné linie)

Jsou charakteru nádorových buněk, plně adaptovány na podmínky in vitro a neomezeně se dělí. Jejich „nesmrtelnost“ je způsobena přítomností telomerázy. Jednou z nejznámějších buněčných linií je HeLa (Henrietta Lacks).

Kultivace pro cytogenetické vyšetření

Chromosomální vyšetření je možné jenom při plné spiralizaci chromosomů a po vhodném zpracování buněk. Přímé zpracování je proto možné jenom u buněk z tkání s vysokou mitotickou aktivitou (kostní dřeň, nádor, choriové klky), ale u většiny ostatních buněk je nutná kultivace.

Pro zjištění, zda je kultivace buněk tkáně nutná a jak dlouho, se používá mitotický index: mitotický index = buňky v mitóze/všechny buňky tkáně * 100%. Vyšetření chromosomů v meiose se standardně neprovádí (výjimkou je vyšetření spermií a vajíček pro účely asistované reprodukce).

Kultivace může být krátkodobá (např. buňky periferní krve – 72 hodin), nebo dlouhodobá (týdny). Kultivuje se v lahvičkách nebo zkumavkách s kultivačním médiem obsahujícím růstové faktory. Teplota při kultivaci je 37 °C, pH musí být konstantní, pro dlouhodobé kultury je důležité, aby bylo 5% CO₂ v atmosféře termostatu. Buňky tkáně se před kultivací mechanicky či enzymaticky rozvolní

Pro postnatální vyšetření se kultivují většinou lymfocyty periferní krve po přidání mitogenu fytohemaglutininu. Pro prenatální vyšetření se používají buňky z plodové vody (amniocentéza – 16. až 18. gestační týden), buňky trofoblastu (biopsie trofoblastu 11. až 12. týden) nebo lymfocyty z fetální krve (kordocentéza – po 20. týdnu)

Zpracování kultury

Ke kultuře lze přidt kolchicin - tím zničíme dělící vřeténko. Kolchicin je jed z ocúnu, doba jeho působení bývá kratší pro metody HRT, kdy se využívají buňky v prometafázi. Pokud přidáme hypotonický roztoku 0,075M KCl, dojde k rozvolnění buněčného obsahu a individualizaci chromosomů. Chromosomy se pak fixují směsí kyseliny octové a methanolu (1:3). Zbývá už jen nakapání preparátu na podložní sklíčko a barvení (např. proužkování).

Odkazy

Související články

• In vitro (heslo)
• Buněčné kultury
• Kultivační půdy
• Množení bakterií in vitro
• Identifikace chromozomů

Externí odkazy

•  In vitro (česká Wikipedie)
•  In vitro (anglická Wikipedie)

Použitá literatura

• KOČÁREK, E., M. PÁNEK a D. NOVOTNÁ. Klinická cytogenetika I : Úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v cytogenetice. 1. vydání. Karolinum, 23006. ISBN 80-246-1069-8.

• OTOVÁ, Berta, et al. Lékařská biologie a genetika I. díl. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2008. 123 s. ISBN 978-80-246-1594-3.