Molekulárně-biologická diagnostika v onkologii

Z WikiSkript

Maligní nádorová onemocnění charakterizuje autonomní invazivní růst nádorových buněk a jejich schopnost vytvářet vzdálené metastázy. Transformace buňky normální v buňku nádorovou závisí obvykle na přítomnosti většího počtu mutací genů různých tříd. Kancerogenně působí ionizující záření, chemické látky či biologická agens (onkogenní viry). Rovněž dědičné mutace specifických genů (např. tumorsupresorových genů) mohou být příčinou vývoje zhoubného nádorového onemocnění.

Sporadický a familiární výskyt nádorových onemocnění[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Sporadický výskyt, který není vázán na genetickou predispozici, ale na působení zevních faktorů, u většiny nádorů výrazně převládá. Mezi hereditární nádorové syndromy, na jejichž vývoji se podílí zejména dědičné mutace nádorových supresorových genů, patří například:

Hereditární nádory často vznikají v nižším věku než nádory sporadické, často jsou bilaterální a typické jsou rovněž nádorové duplicity. Za vývoj hereditárního nádorového onemocnění může odpovídat vyšší počet genů. Například predispozice k nepolypóznímu kolorektálnímu karcinomu se vyskytuje u dědičných mutací řady genů zasahujících do DNA reparačních pochodů.

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce hereditární nádorové syndromy.

Specificita vůči určité tkáni se u mutací jednotlivých tumor supresorových genů výrazně liší. Zárodečné mutace genu RB jsou například spojeny zejména s rizikem (> 90 %) vývoje retinoblastomu (často oboustranného v časném dětském věku); naproti tomu v rodinách s hereditárními mutacemi genu p53 se vyskytují různé nádory: nádory prsu představují 28,1 % všech malignit, nádory mozku 15,1 %, sarkomy měkkých tkání 12,8 %, osteosarkomy 12,3 %, nádory nadledvin 7,1 %, hematologické malignity 3,2 %, ostatní nádory 21,4 %[2].

U pacientů s familiárním výskytem nádorového onemocnění potvrzuje genetické vyšetření jeho hereditární původ. Asymptomatickým rodinným příslušníkům pak poskytuje informaci o nádorové predispozici (o riziku vývoje nádorového onemocnění). U osob s vysokým rizikem nádorového onemocnění (u nosičů mutací) lze navrhnout preventivní screeningový program zaměřený na jeho časnou diagnostiku.

Molekulárně-biologická diagnostika[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Analyzovaný materiál[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Analyzovaným genetickým materiálem je obvykle genomová DNA; někdy se testuje i RNA. Genetický materiál se nejčastěji získává z leukocytů periferní nesrážlivé krve nebo z nádorové tkáně (získané bezprostředně po chirurgickém výkonu nebo archivované v parafinových bločcích). K průkazu mikrosatelitové nestability (MSI – microsatellite instability) nebo ztráty heterozygozity (LOH – loss of heterozygosity) v nádorových buňkách se analyzuje DNA získaná jak z nádorové, tak normální tkáně.

Typy mutací[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Mutace.

Mutace lze definovat jako stabilní změny v nukleotidové sekvenci nebo uspořádání DNA. Při postižení zárodečných buněk se přenáší na potomstvo a mohou být příčinou hereditárních nádorů. Somatické mutace jsou pak významné v genezi sporadických nádorů. Podle typu lze mutace dělit na substituce, které představují tranzice (A ↔ G nebo C ↔ T) nebo transverze (C/T ↔ A/G), delece, inzerce, duplikace a rozsáhlé genomové delece a přestavby. Rozsáhlé delece nebo chromozomové translokace mohou vést k mikroskopicky prokazatelným strukturálním změnám chromozomů. Mutace lze rovněž dělit podle účinku:

  • Synonymní mutace nemění smysl kodonu a nezpůsobuje záměnu aminokyseliny.
  • Missense mutace naopak mění smysl kodonu v důsledku čehož dochází k inkorporaci odlišné aminokyseliny.
  • Nonsense mutace vede ke vzniku stop kodonu, a proto ukončuje translaci.
  • Posunové mutace vedou k posunu čtecího rámce a obvykle i k předčasnému ukončení syntézy proteinu.

Analýza mutací[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Schéma PCR

Při analýze mutací se vhodné genové fragmenty většinou nejdříve amplifikují pomocí PCR (případně RT-PCR) a jejich sekvenční analýza pak slouží k určení mutace. Při použití prescreeningových testů v mutační analýze slouží následné sekvenování k potvrzení a charakterizaci mutace. K prescreeningu mutací genů odpovědných v tumorogenezi lze použít řadu metod. Analýzu polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP-analýzu) lze použít k detekci známých bodových mutací (zasahujících do rozpoznávacích sekvencí restrikčních enzymů), které se typicky vyskytují např. u ras onkogenů. Elektroforetické metody, např. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) a SSCP (single strand conformation polymorphism), patří ke standardním technikám, které detekují změny v nukleotidové sekvenci amplifikovaného fragmentu DNA. Kromě patogenních mutací se těmito metodami detekují i nepatogenní polymorfismy nebo sekvenční varianty, jejichž význam může být sporný (některé missense mutace).

Pomocí PTT (protein truncation test) je možné zachytit patogenní mutace vedoucí k předčasnému ukončení translace (nonsense mutace, posunové mutace). Fragmenty amplifikované pomocí PCR (RT-PCR) nesoucí promotorovou fágovou sekvenci a sekvenci nutnou pro zahájení eukaryontní translace (Kozak sequence) slouží u této techniky jako templát pro syntézu RNA in vitro a následnou translaci (prováděnou v přítomnosti značené aminokyseliny). Syntetizované proteiny se dále separují pomocí polyakrylamidové elektroforézy v přítomnosti SDS (SDS PAGE) a detekují se autoradiograficky. Podle velikosti translačních produktů je možné přibližně lokalizovat mutaci. Metoda umožňuje analyzovat dlouhé genové fragmenty (1000–2000 bp) a používá se při analýzách genů, které jsou ve většině případů inaktivovány mutacemi vedoucími ke zkrácení proteinu (např. gen APC, geny BRCA1/BRCA2).

MLPA a aCGH analýza[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Rozsáhlé genomové delece a přestavby, které mohou v případě některých tumorsupresorových genů představovat více než 10 % patogenních mutací, se obvykle prokazují pomocí MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification)[3], eventuálně aCGH (oligonucleotide array-based comparative genomic hybridization) analýzy[4]. Po ohraničení delece (přibližném určení míst zlomů) se zkrácený genový fragment nesoucí deleci amplifikuje pomocí PCR a delece (genomová přestavba) se charakterizuje na základě sekvenční analýzy.

  • U MLPA-analýzy se změny v počtu genových kopií detekují na základě rozdílů v hybridizaci gen specifických oligonukleotidových sond. Po ukončení hybridizace se sondy specifické vůči jednotlivým exonům spojí DNA ligázou a po následné amplifikaci se produkty PCR odlišné délky rozdělí v genetickém analyzátoru. Vzájemným porovnáním velikostí jednotlivých vrcholů lze provést kvantifikaci všech exonů příslušného genu a určit rozsah genové alterace.
  • U aCGH se určuje počet genových kopií na základě rozdílu v hybridizaci analyzované a referenční DNA. Při použití aCGH specifické pro určitý chromosom s vysokou hustotou oligonukleotidových sond je možné poměrně přesně lokalizovat genovou alteraci (deleci nebo duplikaci).

Ztráta heterozygozity[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Průkaz ztráty heterozygozity intragenových nebo v blízkosti genu ležících mikrosatelitových markerů v nádorových buňkách vypovídá o deleci alely příslušného genu. Typicky se dá ztráta heterozygozity prokázat u hereditárních nádorových syndromů způsobených zárodečnými mutacemi tumorsupresorových genů. Analýza se používá k průkazu inaktivace obou alel tumorsupresorového genu v nádorové tkáni. Nestabilita mikrosatelitů se typicky prokazuje v nádorových buňkách u Lynchova syndromu. Rozdílná délka mikrosatelitových repetitivních sekvencí v nádorové tkáni při srovnání s tkání normální vzniká v důsledku defektu v DNA reparačních pochodech u hereditárních mutací mismatch repair genů.

Minimální reziduální nemoc[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Jako minimální reziduální nemoc (minimal residual disease – MRD) se označuje stav kompletní klinické remise, kdy u pacienta nelze běžnými metodami (např. cytogenetickými) prokázat minimální počet přítomných nádorových buněk. Použitím molekulárně-biologických metod se podařilo výrazně zvýšit citlivost detekce nádorových buněk. Pomocí PCR nebo RT-PCR je možné detekovat jedinou nádorovou buňku ve vzorku s vysokým počtem (až 106) buněk normálních. Většinou se vysoké citlivosti detekce cílového fragmentu DNA (specifického pro nádorové buňky) dosahuje dvoustupňovou amplifikací (nested PCR).

Detekce MRD pomocí PCR analýz se využívá především u hematologických malignit, eventuálně aCGH analýzy[5]. Například u CML lze zachytit pomocí RT-PCR transkript fúzního genu bcr-abl, který se vyskytuje v nádorových buňkách u více než 90 % onemocnění. Stav „kompletní molekulární remise“, kdy po terapii opakovaně nelze pomocí PCR nebo RT-PCR detekovat nádorové buňky, se považuje za příznivý prognostický faktor. V současnosti kvantitativní PCR metody umožňují sledovat v čase přírůstek či úbytek přežívajících nádorových buněk.

Odkazy

Související články

Externí odkazy

Reference

  1. VOGELSTEIN, Bert a Kenneth W. KINZLER. The Genetic basis of human cancer. 1. vydání. New York : McGraw-Hill, 1998. 731 s. ISBN 0-07-067596-1.
  2. TAVASSOLI, Fattaneh A. a Peter DEVILEE. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. 1. vydání. Lyon : IARC Press, 2003. 432 s. World Health Organization classification of tumours; sv. 5. ISBN 92-832-2412-4.
  3. HOGERVORST, FB, PM NEDERLOF a JJ GILLE, et al. Large genomic deletions and duplications in the BRCA1 gene identified by a novel quantitative method. Cancer Res. 2003, roč. 63, s. 1449-1453, ISSN 0008-5472. 
  4. STAAF, J, T TÖRNGREN a E RAMBECH, et al. Detection and precise mapping of germline rearrangements in BRCA1, BRCA2, MSH2, and MLH1 using zoom-in array comparative genomic hybridization (aCGH). Hum Mutat. 2008, roč. 29, s. 555-564, ISSN 1059-7794. 
  5. ČERNÝ, J, M TRNĚNÝ a P KLENER. Význam minimální reziduální nemoci a metody jejího stanovení u pacientů s některými hematologickými malignitami. Klinická onkologie. 2003, roč. 16, s. 41-48, ISSN 0862-495X. 

Použitá literatura[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • VOGELSTEIN, Bert a Kenneth W KINZLER. The Genetic basis of human cancer. 1. vydání. New York : McGraw-Hill, 0000. 731 s. ISBN 0-07-067596-1.
  • TAVASSOLI, Fattaneh A a Peter DEVILEE. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. 1. vydání. Lyon : IARC Press, 2003. 432 s. World Health Organization classification of tumours; sv. 5. ISBN 92-832-2412-4.