Amyláza

Z WikiSkript
Zkontrolováno old.png
Pankreatická amyláza

α-amyláza[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] (AMS, α-1,4-glukan-4-glukan-hydroláza, EC 3.2.1.1) hydrolyzuje α-1-4-glykosidovou vazbu; pH optimum α-amylázy je mezi 7,0–7,2. V organismu se vyskytuje ve dvou formách – jako slinný a pankreatický izoenzym podle orgánového původu. Obě izoformy AMS se od sebe liší cukernou složkou a lze je odlišit elektroforeticky, či podle precipitace pomocí speciálního lektinu nebo protilátky[11]. α-amyláza je tvořena v acinárních buňkách pankreatu a hromadí se v zymogenních granulech. Do střevního lumen se dostává ve formě pankreatického sekretu (pankreatické šťávy) spolu s dalšími trávicími enzymy. Za fyziologických podmínek není molekula enzymu absorbována střevním povrchem a sérová hladina je nízká, odpovídající aktivitě enzymu uvolněného do cirkulace přímo ze žlázových buněk, resp. lymfatickou drenáží. Molekulová hmotnost α-amylázy je 55 000. Z cirkulace je α-amyláza eliminována v ledvinách glomerulární filtrací.

Makroforma enzymu (makroamyláza)[12] [13] [14] [15] [16] vzniká vazbou enzymu na některé bílkoviny krevního séra, především imunoglobuliny, cirkulující imunokomplexy nebo jiné glykoproteiny. Makroforma enzymu má podstatně vyšší molekulovou hmotnost (od 150 000 do 2 000 000) a není proto eliminována glomerulární filtrací. Pro klinickou diagnostiku se stanovuje hladina α-amylázy v séru, v moči a vypočítává se index clearance amylázy/kreatininu.

Laboratorní stanovení koncentrace α-amylázy

Změny hladiny amylázy

Laboratorně lze stanovovat koncentraci proteinu imunologickými technikami nebo enzymovou katalytickou koncentraci pomocí specifických substrátů. Při stanovení jak hmotnostní, tak katalytické koncentrace enzymu je nutno zvažovat přítomnost inhibitorů v séru a vznik makroforem enzymů. Běžně používané stanovení aktivity α-amylázy je založeno na štěpení chromogenního substrátu. Starší postupy, které používaly deriváty přirozeného substrátu, škrobu, byly obtížně standardizovatelné a již se nepoužívají. Současné syntetické substráty jsou odvozeny od maltózy, jako chromogen je nejčastěji používán 4-nitrofenylfosfát. Stanovení izoenzymů α-amylázy je umožněno inhibicí jednoho z obou izoenzymů specifickou monoklonální protilátkou.


Celková α-amyláza v diagnostice

Markery akutní pankreatitidy

Zvýšená hladina celkové aktivity α-amylázy je prokazatelná u celé řady onemocnění. Nejčastějším diagnostickým důvodem je podezření na akutní pankreatitidu. Hladina celkové α-amylázy je sice zvýšena ve 100 % onemocnění akutní pankreatitidou, zvýšena je však i v 80 % všech případů akutních bolestí břicha. Podstatně větší diagnostický přínos má stanovení pankreatického izoenzymu α-amylázy (P-amylázy), jehož hladina je rovněž zvýšena ve 100 % případů akutní pankreatitidy, u akutních bolestí břicha je zvýšena jen v 10 %. V běžné klinické praxi se používá kritéria pětinásobného zvýšení celkové amylázy, které je diagnostickým indikátorem akutní pankreatitidy. Zvýšená sérová hladina je samozřejmě prokazatelná u akutních i chronických onemocnění ledvin, u střevních zánětů ve 30 % případů akutní apendicitidy. Zvýšení hladiny α-amylázy v moči u akutní pankreatitidy přetrvává déle a nastupuje později než zvýšení hladiny v séru. Slinný typ α-amylázy (S-amyláza) je zvýšen u onemocnění slinných žláz, u některých plicních chorob, u řady maligních tumorů, ovariální cysty, mimoděložního těhotenství. Normální hodnoty poměru clearance amylázy a kreatininu jsou mezi 2–4 %, při pankreatitidě stoupá index na 10 %. Zvýšený index clearance amylázy/kreatininu byl prokázán např. u diabetické ketoacidózy, popáleninách, myelomu a u ledvinných poruch. Snížení indexu clearance je diagnosticky významné pro makroamylázémii.

Existují i specifické metody pro stanovení slinné α-amylázy, např. ELISA s monoklonální protilátkou.


Průkaz makroamylázového komplexu v séru

Makroamyláza a je příčinou 8–12 % případů hyperamylázemie (zvýšené hodnoty celkové sérové hladiny α-amylázy). Příčinou je makrokomplex enzymu s vysokomolekulárními proteiny séra, především s imunoglobuliny IgA a IgG. Obdobný makrokomplex tvoří i další enzymy a to např. pankreatická lipáza. Makroformu α-amylázy lze stanovit gelovou filtrací, elektroforeticky, precipitací s PEG nebo ELISA technikou. Kvantitativní stanovení poměru makroformy enzymu je nejpřesnější s použitím gelové chromatografie na Sephadexu® G-100. Separace probíhá v chlazeném boxu při 10 °C na koloně 9 × 150 mm při průtoku 3 ml/hod 5 hodin. Aktivita α-amylázy je v jednotlivých frakcích stanovena enzymaticky standardním postupem s pNP blokovaným maltoheptaosidem a výsledkem je poměr obou forem enzymu.

Důležitým aspektem pro průkaz makroamylázového komplexu je nestabilita komplexu s imunoglobuliny. Při zmražení a rozmražení séra dochází k disociaci komplexů, makroamylázu je proto nutné prokazovat v čerstvě odebraném vzorku séra.

Referenční hodnoty: Makroforma enzymu není za fyziologických podmínek přítomna. Výsledek testu je udáván v procentuálním poměru makroformy amylázy vypočtené z aktivit jednotlivých frakcí. Pozitivní výsledek, průkaz komplexu, je tedy hodnota > 0.


Stanovení pankreatické amylázy ve stolici

Stanovení pankreatické amylázy ve stolici[17] [18] [19] [20] je relativně málo používaný test, který je rovněž imunochemickým průkazem s protilátkou k lidské pankreatické amyláze – novinka, která se objevila v roce 2000. Normální hodnoty jsou nad 360 µg/g stolice, kalibrační standardy jsou v rozmezí 0–12 000 µg/g. Test je založen na ILMA (ImmunoLuminoMetric Assay) principu s luminiscenčním měřením markerem je akridinium ester. Původní práce o stanovení pankreatické amylázy ve stolici popisují především detekci izoenzymů a korelaci s dalšími pankreatickými enzymy ve stolici u nemocných s pankreatickou insuficiencí.


Odkazy

Zdroj

  • se svolením autora převzato z KOCNA, Petr. GastroLab : MiniEncyklopedie laboratorních metod v gastroenterologii [online]. ©2002. Poslední revize 2011-01-08, [cit. 2011-03-04]. <http://www1.lf1.cuni.cz/~kocna/glab/glency1.htm>.

Reference

  1. CARROLL, Jennifer K, Brian HERRICK a Teresa GIPSON. Acute Pancreatitis: Diagnosis, Prognosis, and Treatment. American Family Physician [online]. 2007, vol. 75, no. 10, s. 1513-1520, dostupné také z <https://www.aafp.org/afp/2007/0515/p1513.pdf>. ISSN 0002-838X. 
  2. KOCNA, Petr a Tomáš ZIMA. Hyperamylazémie, laboratorní a klinické aspekty. Časopis lékařů českých [online]. 2006, vol. 145, s. 449-452, dostupné také z <https://www.prolekare.cz/casopis-lekaru-ceskych-clanek?id=3093>. ISSN 1803-6597. 
  3. QUARINO, L, Q DANG a J HARTMANN. An ELISA method for the identification of salivary amylase. Journal of forensic sciences. 2005, vol. 50, no. 4, s. 873-876, ISSN 0022-1198. 
  4. SMITH, Ross C, James SOUTHWELL-KEELY a Douglas CHESHER. Should serum pancreatic lipase replace serum amylase as a biomarker of acute pancreatitis?. ANZ journal of surgery [online]. 2005, vol. 75, no. 6, s. 399-404, dostupné také z <https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/j.1445-2197.2005.03391.x?cookieSet=1>. ISSN 1445-1433. 
  5. PANTEGHINI, Mauro, Ferruccio CERIOTTI a Franca PAGANI, et al. Recommendations for the routine use of pancreatic amylase measurement instead of total amylase for the diagnosis and monitoring of pancreatic pathology. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine [online]. 2002, vol. 40, no. 2, s. 97-100, dostupné také z <https://www.degruyter.com/doi/abs/10.1515/CCLM.2002.017>. ISSN 1434-6621. 
  6. TREACY, John, Anthony WILLIAMS a Renz BAIS, et al. Evaluation of amylase and lipase in the diagnosis of acute pancreatitis. ANZ Journal of Surgery [online]. 2001, vol. 71, no. 10, s. 577-82, dostupné také z <https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1046/j.1445-2197.2001.02220.x?cookieSet=1>. ISSN 1445-1433. 
  7. PEZZILLI, R, G TALAMINIL a L GULLO. Behaviour of serum pancreatic enzymes in chronic pancreatitis. Digestive and Liver Disease. 2000, vol. 32, no. 3, s. 233-237, ISSN 1590-8658. 
  8. KEIM, V, N TEICH a F FIEDLER, et al. A comparison of lipase and amylase in the diagnosis of acute pancreatitis in patients with abdominal pain. Pancreas. 1998, vol. 16, no. 1, s. 45-49, ISSN 0885-3177. 
  9. CHASE, CW, DE BARKER a WL RUSSELL. Serum amylase and lipase in the evaluation of acute abdominal pain. The American surgeon. 1996, vol. 62, no. 12, s. 1028-1033, ISSN 0003-1348. 
  10. MALFERTHEINER, P a J ENRIQUE DOMÍNGUEZ-MUÑOZ. Clinical and laboratory diagnosis of acute pancreatitis. Annali italiani di chirurgia. 1995, vol. 66, no. 2, s. 165-170, ISSN 0003-469X. 
  11. RACEK, Jaroslav, et al. Klinická biochemie. 2. vydání. Praha : Galén, 2006. 329 s. s. 87. ISBN 80-7262-324-9.
  12. BERMEJO, JF, J CARBONE a JJ RODRIGUEZ, et al. Macroamylasaemia, IgA hypergammaglobulinaemia and autoimmunity in a patient with Down syndrome and coeliac disease. Scandinavian journal of gastroenterology. 2003, vol. 38, no. 4, s. 445-447, ISSN 0036-5521. 
  13. LAWSON, GJ. Prevalence of macroamylasaemia using polyethylene glycol precipitation as a screening method. Annals of clinical biochemistry. 2001, vol. 38(Pt 1), s. 37-45, ISSN 0004-5632. 
  14. VENTRUCCI, M, A CIPOLLA a M MIDDONNO, et al. Macroamylase detection in serum using selective precipitation: a rapid and reliable assay. Italian journal of gastroenterology and hepatology. 1999, vol. 31, no. 9, s. 846-849, ISSN 1125-8055. 
  15. CUTOLO, M, A SULLI a A BARONE, et al. Macroamylasemia: a possible cause of unexplained hyperamylasemia in rheumatoid arthritis. British journal of rheumatology. 1995, vol. 34, no. 3, s. 290-292, ISSN 0263-7103. 
  16. HORTIN, GL, AL SUMMERFIELD a TR WILHITE, et al. Detection of autoantibodies to amylase by ELISA: comparison of detection of macroamylase and free autoantibody. Clinical chemistry [online]. 1994, vol. 40, no. 12, s. 2254-2259, dostupné také z <http://clinchem.aaccjnls.org/content/clinchem/40/12/2254.full.pdf,>. ISSN 0009-9147. 
  17. MORIYOSHI, Yuriko, Tadashi TAKEUCHI a Keiko SHIRATORI. Fecal isoamylase activity in patients with pancreatic diseases. Pancreas. 1991, vol. 6, no. 1, s. 70-76, ISSN 0885-3177. 
  18. GROMASHEVSKAIA, LL, GF STREMETSKII a TV BOGATYR'. Opredelenie izofermentov amilazy v kale. Laboratornoe delo. 1981, roč. 1981, no. 10, s. 609-612, ISSN 0023-6748. 
  19. MÜLLER, G. Fakale Enzymdiagnostik. Deutsche Zeitschrift für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten. 1979, vol. 39, no. 6, s. 257-265, ISSN 0012-1053. 
  20. HINTNER, I, G MÜLLER a A THEUNE. Bestimmungen von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase und alpha-Amylase im Stuhl. Zeitschrift für die gesamte innere Medizin und ihre Grenzgebiete. 1977, roč. 15, vol. 32, no. 12, s. 292-295, ISSN 0044-2542.