Biochemická vyšetření jater

Z WikiSkript

Jaterní tkáň

Játra mají nezastupitelnou roli v intermediárním a energetickém metabolismu sacharidů, lipidů a dusíkatých látek, zabezpečují inaktivaci a exkreci endogenních látek a detoxikaci exogenních látek, jsou hlavním místem syntézy plazmatických proteinů a koagulačních faktorů.

Onemocnění jater vyvolává změny četných biochemických parametrů v séru. Laboratorní testy poskytující informaci o různých funkcích jater a jsou důležité pro diagnostiku jaterních chorob. Na základě jejich stanovení lze odhadnout intenzitu poškození jaterního parenchymu.

Pro pochopení interpretace výsledků „jaterních testů” je nezbytná znalost morfologie jaterní tkáně. Asi 72 % tvoří hepatocyty. Kupfferovy buňky, endotel a tukové buňky se podílejí asi 8 % a 1 % buněk tvoří žlučové cesty. Zbytek z celkového objemu jater představuje extracelulární tekutina. Rozsah poškození jednotlivých struktur se liší podle typu onemocnění. Akutní poškození jater (např. virové hepatitidy) je charakterizováno porušením především hepatocytů. U jiných onemocnění může dominovat porucha odtoku žluči spojená s poškozením buněk žlučových kapilár.

Biochemické vyšetření jater

Biochemické testy určené pro vyšetřování jater a žlučových cest můžeme rozdělit do několika skupin:

Ukazatele poškození hepatocytu

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Parametry poškození hepatocytu.

V důsledku poškození cytoplazmatické membrány, např. zánětem nebo hypoxií, dochází ke zvýšení její propustnosti a do extracelulárního prostoru se uvolňují enzymy lokalizované v cytoplazmě. Nejcitlivějším indikátorem porušení membrány hepatocytu je zvýšený únik alaninaminotransferázy (ALT) do cirkulace. Dalšími enzymy, které pronikají z hepatocytů do cirkulace, je cytoplazmatický izoenzym aspartátaminotransferázy (cAST) a jaterní izoenzym laktátdehydrogenázy (LD5). Zvýšení aktivity cytoplazmatických enzymů v séru je známkou reverzibilního poškození hepatocytu.

Při závažnějším onemocnění jater doprovázeném rozpadem hepatocytu (nekrózou) se do cirkulace dostávají nejen cytoplazmatické enzymy, ale i enzymy lokalizované v mitochondriích. Diagnostický význam má především glutamátdehydrogenáza (GMD) a mitochondriální izoenzym AST (mAST). Nález zvýšených aktivit mitochondriálních enzymů svědčí pro ireverzibilní, prognosticky závažné postižení jater.

Ukazatele cholestázy

Cholestáza neboli městnání žluči v játrech může vzniknout z mechanických příčin (obstrukce žlučových cest konkrementem nebo tumorem) nebo z poruchy funkce, např. zánětem, působením některých léků nebo na podkladě dědičných poruch. Cholestáza je doprovázena zvýšením aktivity enzymů nacházejících se v membráně endotelu žlučovodů a v kanalikulární membráně hepatocytů a poruchou odtoku bilirubinu do střev. V klinické praxi se běžně vyšetřují enzymy alkalická fosfatáza (ALP) a γ-glutamyltransferáza (GGT), dále bilirubin v krvi a moči a urobilinogen v moči.

Ukazatele biosyntetických funkcí jater

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Parametry syntetické funkce jater.

Intenzitu proteosyntetických funkcí jater odráží především stav zrnitého endoplazmatického retikula, kde probíhá tvorba většiny plazmatických bílkovin, ale i syntéza tzv. „exportních proteinů” jako jsou některé enzymy (např. cholinesteráza) a koagulační faktory. Stanovení těchto analytů má význam především u chronických jaterních onemocnění. Na rozdíl od enzymů cytoplazmatických a mitochondriálních, jejichž aktivita se při poškození jater zvyšuje, se pokles proteosyntézy projeví jejich snížením. Pro diagnostické účely se používá především stanovení sérové cholinesterázy, sérového albuminu nebo transferinu a koagulačních faktorů.

Vybraná biochemická vyšetření u jaterních onemocnění

Aminotransferázy

Aminotransferázy jsou enzymy, katalyzující transaminaci, jejíž podstatou je přenos aminoskupiny z aminokyseliny na ketokyselinu a naopak. Z klinicko-biochemického hlediska jsou nejdůležitější alaninaminotransferáza a aspartátaminotransferáza.

Alaninaminotransferáza

Alaninaminotransferáza (ALT, EC 2.6.1.2) katalyzuje transaminační reakci, při níž se reverzibilně přenáší aminoskupina z alaninu na 2-oxoglutarát za vzniku pyruvátu a glutamátu. Kofaktorem je pyridoxal-5´-fosfát.

ALT je obsažena nejvíce v játrech, v jiných orgánech (kosterní sval, myokard a další) je její aktivita mnohem nižší. Na rozdíl od AST je lokalizována pouze v cytoplazmě.

Stanovení ALT je citlivým a relativně specifickým testem pro poškození hepatocytu. Její aktivita v séru se zvyšuje již při malém poškození jaterní buňky, které je způsobeno zvýšenou propustností cytoplazmatické membrány. U zánětu jater (např. virová hepatitida) je zvýšení ALT nejčasnějším indikátorem porušení celistvosti membrány hepatocytu. Sledování ALT je vhodné pro monitorování průběhu onemocnění.

Fyziologické hodnoty S-ALT
muži do 0,80 μkat/l
ženy do 0,60 μkat/l

Aspartátaminotransferáza

Aspartátaminotransferáza (AST, EC 2.6.1.1, anglicky SGOT (serum glutamic-oxaloacetic transaminase) katalyzuje reverzibilní přenos aminoskupiny z aspartátu na 2-oxoglutarát. Kofaktorem reakce je podobně jako u ALT pyridoxal-5´-fosfát.

AST se ve větší míře vyskytuje v řadě orgánů – v játrech, myokardu, kosterním svalstvu, ledvinách, pankreatu a v erytrocytech. Existuje ve formě dvou izoenzymů – mitochondriálního, který je přítomen v mitochondriích a představuje asi 70 %, a cytoplazmatického, lokalizovaného v cytoplazmě, který je zastoupen asi z 30 %. Cytoplazmatická frakce se uvolňuje do cirkulace snadno i při mírném poškození hepatocytů, a to při narušení permeability jejich buněčné membrány. Mitochondriální frakce se dostává do krve až při nekróze (rozpadu) jaterní buňky. Výrazné zvýšení aktivity AST v séru je proto známkou rozpadu hepatocytů, neboť do cirkulace se uvolňují oba izoenzymy.

Protože AST není specifická pouze pro jaterní tkáň, její zvýšení může doprovázet i poškození kosterního svalstva a myokardu. AST stoupá v krvi u akutního infarktu myokardu a po operacích srdce, ale i po dlouhotrvající fyzické námaze. Stanovení AST falešně pozitivně ovlivňuje hemolýza, neboť v erytrocytech je obsažena v poměrně vysokém množství.


Fyziologické hodnoty S-AST
muži do 0,85 μkat/l
ženy do 0,60 μkat/l

Klinicko-biochemické využití

Aminotransferázy se významně uplatňují v klinicko-biochemické diagnostice jaterních onemocnění.

Pro akutní virovou hepatitidu je charakteristické mnohonásobné zvýšení katalytické koncentrace AST a ALT. Vzestup na 2–3 násobné hodnoty je zaznamenáván již v prodromálním stádiu, vrcholí 7.–12. den po nástupu ikteru (maximum až 100 μkat/l). Normalizace hladin je zaznamenávána obvykle 5.–8. týden. Výrazně (řádově desetinásobně), ale jen krátkodobě bývají transaminázy zvýšené při těžkých biliárních kolikách. Ostatní jaterní léze jsou zpravidla doprovázeny mírnějším, maximálně pětinásobným vzestupem aktivity a při chronických onemocněních jater bývají aktivity transamináz často jen těsně nad horní hranicí referenčního rozmezí.

Obecně se dá říci, že míra vzestupu transamináz dobře odráží rozsah jaterního poškození. Je však třeba mít na paměti, že při úbytku funkční jaterní tkáně, např. při cirhóze jater, se může množství buněk, ze kterých se mohou transaminázy uvolnit, snížit natolik, že sérové aktivity transamináz spadají do referenčního rozmezí nebo jen těsně nad něj i při rozsáhlé jaterní lézi.

S mírným nespecifickým vzestupem obou transamináz se můžeme setkat i po intenzivní fyzické námaze (dochází k jejich uvolnění z kosterního svalstva) a také u obézních osob.

Metody stanovení ALT a AST

Pro stanovení koncentrace katalytické aktivity AST a ALT je doporučena metoda založená na principu Warburgova optického testu.

Aspartátaminotransferáza
Stanovení aktivity AST využívá dvoustupňové reakce.
Stanovení katalytické koncentrace AST.MD – malátdehydrogenáza
  • V první enzymové reakci, katalyzované AST, která je přítomna ve vyšetřovaném vzorku, se tvoří oxalacetát.
  • Vzniklý oxalacetát je v další indikační reakci účinkem enzymu malátdehydrogenázy (MD) redukován na malát za současné oxidace NADH na NAD+. Aktivitu AST stanovíme kineticky na základě rychlosti úbytku NADH v průběhu reakce měřením absorbance při 334, 340 nebo 365 nm. Katalytická koncentrace AST je úměrná poklesu absorbance.
  • V reakční směsi pro stanovení AST je kromě substrátu (L-aspartát a 2-oxoglutarát), malátdehydrogenázy a NADH přítomen pyridoxal-5´-fosfát a laktátdehydrogenáza. Přídavek pyridoxal-5´-fosfátu zabezpečuje dostatečnou saturaci AST a tím zajišťuje plnou aktivitu enzymu. Přítomnost laktátdehydrogenázy je nezbytná k tomu, aby se zajistila redukce endogenního pyruvátu (přítomného ve vzorku), která rovněž spotřebovává NADH, a tím se zabránilo získání falešně vyšších výsledků. Tyto reakce probíhají během 5–15 minutové preinkubace séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu.
  • Po preinkubaci startujeme reakci katalyzovanou AST přidáním 2-oxoglutarátu. Po krátké lag fázi je monitorována ΔA odečítáním absorbance v minutových intervalech po dobu několika minut nebo kontinuálním sledováním. Protože počáteční absorbance reakční směsi má vyšší hodnotu, doporučuje se provádět odečet proti slepé zkoušce, kterou může být např. roztok dvojchromanu draselného.
Alaninaminotransferáza
Stanovení ALT je podobně jako stanovení AST založeno na dvoustupňové reakci.

Princip je stejný jako u AST, pouze jako donor aminoskupiny slouží místo aspartátu alanin a jako enzym pro indikační reakci je použita laktátdehydrogenáza (LD), která zároveň plní funkci enzymu zabezpečujícího redukci endogenních oxokyselin.

Stanovení katalytické koncentrace ALT. LD – laktátdehydrogenáza
Postup
  • V první enzymové reakci, katalyzované alaninaminotransferázou přítomnou ve vzorku, vzniká z alaninu pyruvát.
  • Vznikající pyruvát je redukován na laktát v indikační reakci katalyzované laktátdehydrogenázou přidanou společně s NADH do reakční směsi. Redukce pyruvátu na laktát je doprovázena úbytkem NADH, který se projeví poklesem absorbance při 334, 340 nebo 365 nm. Katalytická koncentrace ALT je úměrná poklesu absorbance.
  • Podobně jako v případě AST vyžaduje pracovní postup 5–15 minutovou preinkubaci séra v reakční směsi bez 2-oxoglutarátu. Reakce je startována 2-oxoglutarátem.

γ-glutamyltransferáza

γ-glutamyltransferáza (GGT, dříve též GMT, EC 2.3.2.2) je klíčovým enzymem γ-glutamylového cyklu, který zabezpečuje transport některých aminokyselin a peptidů přes buněčnou membránu z extracelulární tekutiny do buněk.

Reakce katalyzovaná GGT

GGT katalyzuje přenos γ-glutamylové skupiny: z γ-glutamylpeptidů na jiné peptidy, aminokyseliny nebo vodu. Donorem γ-glutamylového zbytku je tripeptid glutathion (γ-glutamylcysteinylglycin) nacházející se v buňkách živočichů, rostlin i bakterií. Chrání organismus před oxidačním stresem (podílí se na odstraňování peroxidu vodíku). Je obnovován reakcí katalyzovanou glutathionreduktázou.

Výskyt GGT

  • membrány buněk s vysokou sekreční nebo absorpční kapacitou
  • játra – mikrozomální frakce hepatocytů a membrány buněk výstelky žlučových cest
  • proximální tubuly ledvin, enterocyty, pankreas

Syntézu GGT indukují některé látky (barbituráty, antidepresiva, alkohol). GGT se také může uvolnit z membrán detergentním působením, např. žlučových kyselin nebo alkoholu.

γ-glutamylový cyklus

Hodnocení sérové aktivity GGT

Zvýšení GGT je typické především pro poškození hepatobiliárního traktu:

  • intrahepatální nebo extrahepatální cholestáza – v těchto případech je zvýšena i alkalická fosfatáza;
  • hepatocelulární poškození – akutní a chronická jaterní onemocnění;
  • vysoké izolované zvýšení GGT může být známkou poškození jater z důvodů chronického požívání alkoholu; zvýšená aktivita je u alkoholiků i v případě, že ještě nejsou poškozena játra (indukce syntézy GGT);
  • nádory jater a pankreatu.

Stanovení GGT

Princip stanovení vychází z reakce, kterou GGT katalyzuje fyziologicky v organismu. Sleduje se přenos γ-glutamylového zbytku ze substrátu na akceptor, kterým je glycylglycin. Jako substráty se používají L-γ-glutamyl-p-nitroanilid nebo L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid. V průběhu reakce se po přenosu γ-glutamylového zbytku na akceptor uvolňuje barevný p-nitroanilin (ze substrátu L-γ-glutamyl-p-nitroanilidu) nebo 5-amino-2-nitrobenzoát (ze substrátu L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidu), jejichž přírůstek je přímo úměrný aktivitě GGT ve vyšetřovaném vzorku.

Fyziologické hodnoty fS-GGT
muži 0,14–0,84 μkat/l
ženy 0,14–0,68 μkat/l

Fyziologicky jsou vyšší hodnoty GGT u mužů vzhledem k vyššímu obsahu v prostatě.


[zdroj?]

Karbohydrátdeficientní transferin

Za nejlepší biochemický marker jedné z nejčastějších příčin poškození jater, abusu alkoholu, byla do nedávna považována γ-glutamyltransferáza (GGT). V současné době přibývá další parametr, karbohydrát deficientní transferin (CDT).

Transferin obsahuje jako glykoprotein ve své molekule obvykle čtyři až šest zbytků kyseliny sialové. Při chronickém abusu alkoholu (60 g alkoholu za den po dobu alespoň dvou až tří týdnů) se zvyšuje podíl transferinu, v jehož struktuře kyselina sialová chybí (0-2 sialové kyseliny na molekulu) – tzv. karbohydrát deficientní transferin (CDT). Za známku chronického abusu alkoholu se považuje, překročí-li podíl CDT 6 % z celkového transferinu. Hladina CDT zůstává zvýšena ještě asi 2 týdny od začátku abstinence.