Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku

Z WikiSkript

Součástí mnoha patologických, ale i fyziologických biochemických pochodů jsou reakce s radikálovým mechanismem. Účastní se jich především specificky reagující látky obsahující kyslík, tzv. reaktivní formy kyslíku (ROS, reactive oxygen species), nebo dusík, tj. reaktivní formy dusíku (RNS, reactive nitrogen species). Reaktivní formy dusíku vždy obsahují i kyslík, který se jejich reakcí obvykle účastní, proto je označujeme i jako reaktivní formy kyslíku a dusíku, RONS (reactive oxygen and nitrogen species).

ROS a RNS zahrnují jednak volné radikály, jednak látky, které volnými radikály nejsou (proto název reaktivní formy). Jako volný radikál označujeme jakoukoliv chemickou entitu, tj. atom, molekulu nebo ion, která má ve vnější sféře svého elektronového obalu alespoň jeden nespárovaný elektron, což jí propůjčuje relativně vysokou reaktivitu, a která je přitom schopna samostatné existence.

Reaktivní formy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Reagují s MK, lipidy, AMK, proteiny, mono a polynukleotidy (NK), s řadou nízkomolekulárních metabolitů, s koenzymy atd. Jsou významnými prostředníky přenosu energie, faktory imunitní ochrany, signální molekuly buněčné regulace. Za patologických podmínek většinou působí toxicky.

Vznik[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

a. Homolytické štěpení kovalentní vazby – nutno dodat velké množství energie;
b. redukce – přidání jednoho e;
c. oxidace – ztráta jednoho e.


Vznik radikálů může být iniciací radikálové řetězové reakce, reakce se pak propaguje do okolí, dokud nenarazí na další radikál – terminace.

Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species)[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Dlouhodobé vdechovaní čistého kyslíku působí na člověka toxicky. Reaktivní formy se tvoří i při normálním zásobování kyslíkem, pro některé děje v organismu jsou nezbytné. Reaktivní formy jsou volné radikály vytvořené z molekuly kyslíku, které obsahují nepárový elektron a sloučeniny kyslíku, ze kterých mohou radikály vznikat.

  1. Volné radikály (volné kyslíkové radikály, VKR):
    • Superoxid – O2•−.
    • Hydroxylový radikál – HO.
    • Peroxyl – ROO.
    • Alkoxyl – RO.
    • Hydroperoxyl – HO2.
  2. Látky, které nejsou volnými radikály:
    • Peroxid vodíku – H2O2.
    • Kyselina chlorná – HClO.
    • Ozon – O3.
    • Singletový kyslík – 1O2.

Vznik ROS[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Vznik ROS

Jednoelektronovou redukcí kyslíku vzniká superoxid O2•− (superoxidový anion – záporný náboj, radikál – nepárový elektron). Ten je schopen dismutovat (vykazovat jak oxidační tak redukční vlastnosti při vzájemné reakci). Reakce probíhá probíhá spontánně a v organismu je urychlována enzymem superoxiddismutázou.

Peroxid vodíku pak může spolu s superoxidem v přítomnosti Fe2+ nebo Cu+ tvořit hydroxylový radikál, vysoce reaktivní formu vytvářející např. lipoperoxidy. Může se protonizovat na hydroperoxylový radikál.


V přítomnosti tranzitních kovů (Fe2+, Cu+) se H2O2 redukuje Fentonovou reakcí a vzniká vysoce aktivní a toxický hydroxylový radikál.

Fentonova reakce:

H2O2 + Fe2+ → HO + OH + Fe3+

V přítomnosti dalšího elektronu a protonu se rozpadne na vodu a na hydroxylový radikál.

Excitací elektronu v molekule kyslíku spojenou se změnou spinu jednoho z vnějších elektronů vzniká reaktivní forma = singletový kyslík. Vzniká z O2 působením vysoceenergetického zdroje (záření). Reaguje rychle s MK za vzniku lipidových peroxidů.

V dýchacím řetězci probíhá základní čtyřelektronová redukce molekulárního kyslíku na 2 molekuly vody:

  • přijetím 1. e: O2 → O2•−;
  • přijetím 2. e: O2•− → H2O2;
  • přijetím 3. e: H2O2 → H2O + HO (nejreaktivnější z ROS radikálů);
  • přijetím 4. e: HO → H2O.

Tato reakce probíhá v aktivním centru cytochromoxidázy v mitochondriích (respirační řetězec).


Kyselina chlorná (HClO) je syntetizována granulocyty (pomocí myeloperoxidázy):

  • Nejprve vzniká superoxid účinkem granulocytární NADPH-oxidázy:
O2 + NADPH → O2•− + NADP+.
  • Dismutací superoxidu vznikne peroxid vodíku H2O2, a ten následně oxiduje chloridové anionty na kyselinu chlornou:
H2O2 + Cl → HClO + OH.

ROS vznikají při:

  • Oxidaci hypoxantinu se xantinoxidázou na kyselinu močovou.
  • Vzniku chlornanů v neutrofilních granulocytech.
  • Interakci kyslíku s chinony a katecholaminy z toxických látek s nitroaromatickými sloučeninami či tetrachlormetanem.
  • Syntéze eikosanoidů.
  • Fagocytóze, během které se spotřebuje vysoký počet molekul kyslíku = respirační vzplanutí.
  • Přítomnosti vysokoenergetického záření (elektrické pole, jiskření, elektromagnetické pole, UV záření, laser, polarizované světlo) v ovzduší ze smogu a výfukových plynů nebo cigaretového kouře.

Zdroje ROS[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Superoxid[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

  • Mitochondrie

Nejvýznamnější zdroj superoxidu pochází z dýchacího řetězce. Primárně se tvoří superoxid, sekundárně peroxid vodíku. Hlavním producentem ROS v respiračním řetězci jsou komplex I a komplex III.

Superoxid vzniká z oxokomplexu cytochromu P450.

Superoxid vzniká při vzniku baktericidních látek NADPH-oxidázou, která tyto reakce katalyzuje. Produkují také HClO (myeloperoxidázou). Indukují tvorbu NO a tím i tvorbu peroxynitritu. Všechny tyto látky jsou používány proti cizím strukturám (bakterie atd.).

V malém množství vzniká superoxid při oxidaci hemoglobinu na methemoglobin. Erytrocyty usilují zejména o ochranu vlastních struktur proti radikálům.

Peroxid vodíku[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Vzniká především dismutací superoxidu. Též tvořen dvouelektronovou redukcí kyslíku působením oxidáz (monoaminooxidáza, glutathionoxidáza, xanthinoxidáza).

Xanthinoxidáza oxiduje substráty a e předává na NAD+, který je tím redukován. V patologické situaci se D forma konvertuje na O formu, která není schopná předávat e na NAD+ a ty se pak předají na kyslík, z něhož vzniká superoxid (jednoelektronovou redukcí O2) nebo peroxid vodíku (dvouelektronovou redukcí O2).

Reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species)[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Volné radikály:

  • Oxid dusnatý – NO;
  • Oxid dusičitý – NO2.

Látky, které nejsou volnými radikály:

  • Nitrosyl – NO+;
  • Nitroxid – NO;
  • Peroxynitrit – ONOO;
  • Alkylperoxynitrit – ROONO.

Oxid dusnatý[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Má krátký biologický poločas. Je vychytáván erytrocyty, ve kterých reaguje s hemoglobinem za vzniku methemoglobinu a nitrátu. Dobře se váže na hemové železo guanylátcyklázy, (podstata stimulace cGMP vedoucí k myorelaxaci).

Peroxynitrit[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Nejvýznamnější toxický produkt oxidu dusnatého. Vzniká reakcí NO se superoxidem. Je oxidačním činidlem. Nejvýkonnější producent volných radikálů v buňkách.

NO + O2•− → OONO

Zdroje RNS[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Oxid dusnatý[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

K syntéze potřebuje:

  • 4 kofaktory (Hem, FAD, FMN, H4-biopterin);
  • 2 kosubstráty (O2, NADPH);
  • NO synthasy (NOS – nitric oxide synthases) – katalyzují syntézu NO;
  • NOS I (ncNOS – mozková, konstitutivní);
  • NOS II (iNOS) – enzym makrofágů, neutrofilů, hepatocytů, chondrocytů, buněk cévní svaloviny, buněk Langerhansových ostrůvků. Exprese genu pro NOS II je stimulována cytokiny a mikroby;
  • NOS III (ecNOS – endotelová, konstitutivní) – tvoří tzv. EDRF, má vazodilatační účinek.

Poškození biomolekul[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Mezi hlavní cílové struktury řadíme:

Nenasycené MK v lipidech (buněčné membrány).

Poškození mastných kyselin může způsobit ztrátu dvojných vazeb a podmíní tvorbu reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy). To způsobí změnu fluidity a propustnosti membrán. Dojde ke vzniku chemoreaktivních látek pro mikrofágy.

Proteiny

Poškození proteinů může způsobit jejich agregaci, síťování, fragmentaci, štěpení, reakci s hemovým železem, modifikace thiolových skupin a benzenovách jader AMK. To způsobí změny v transportu iontů (vstup Ca2+ do cytosolu) a změny v aktivitě enzymů.

DNA

Poškození DNA může způsobit štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce. To se pak může projevit jako mutace, translační chyby a inhibice proteosyntézy.

Poškození enzymových komplexů a buněčné signalizace[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Lipidy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Nejdůležitější reakce – peroxidace lipidů. Takové změny nejintenzivněji vyvolávají hydroperoxylový a hydroxylový radikál, zvláště superoxid. Nejcitlivější terč je fosfolipidová dvojvrstva membrán a v nich hlavně místa dvojných vazeb nenasycených MK a to kyseliny linolové a linoleové. Membrány postižené lipoperoxidací podmíní změnu permeability. Vedlejší produkt je malondialdehyd. Stanovením jeho koncentrace odpovídá míře lipoperoxidace. Už vzniklé peroxidy se likvidují glutathionperoxidázou. Projevem oxidačního poškození lipidů je pigment ve stařeckých skvrnách.


Každá látka, která má dostatečnou afinitu k elektronům a dokáže vytrhnout vodíkový atom z methylenové skupiny uhlovodíkového řetězce MK, může zahájit radikálovou reakci (MK nebo lipid se stává radikálem). Po vytržení vodíku (iniciace) vzniká konjugovaný dién (mezi dvěma dvojnými vazbami vzniká jedna jednoduchá), který snadno reaguje s O2 za vzniku peroxylového radikálu (LOO). Peroxylový radikál vytrhne e z MK sousedícího lipidu, z něhož vznikne nový radikál a z peroxylového radikálu vznikne hydroperoxid (LOOH). Reakce se propaguje dokud se radikál nesetká s dalším radikálem nebo vitaminem E, kdy se reakce zastaví tím, že vznikne stálá sloučenina (terminace radikálové reakce). Výsledkem této reakce je vznik hydroperoxidů a cyklických peroxidů MK (poměrně stálé). V případě, že se však potkají s tranzitním kovem (Fe), mění se na alkoxylové radikály LO.

Rozeznáváme dva typy peroxidace:

  • Neenzymová – škodlivá, často vyvolaná patologickým faktorem. Vzniká směs různých produktů způsobujících škody (váží se na proteiny, mění fluiditu membrán, zvyšují propustnost pro ionty, snižují membránový potenciál).
  • Enzymová – fyziologická, probíhá v aktivních centrech hydroperoxidáz a endoperoxidáz (cyklooxygenáza, lipoxygenáza). Volné radikály jsou přirozené meziprodukty těchto reakcí, jsou ale vázané na enzym (nepůsobí problémy).

Proteiny[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Volné radikály mohou oxidovat AMK zbytky, čímž dojde ke ztrátě enzymové aktivity, signální nebo transportní funkce. Dále mohou způsobit hydroxylaci proteinů (hydroxylovým radikálem. Způsobují nitrace peroxynitritem (zejména Phe, Tyr, Trp).

Peroxidace lipidů vede k agregaci a síťování membránových proteinů a lipoproteinových částic v důsledku tvorby radikálů.

Lyzylový zbytek slouží jako ligand schopný vázat Fe2+, čili s peroxidem dává Fentonovou reakci.

Přítomností HO vzniká modifikovaný protein, který je následně odstraňován proteásami. Následkem toho enzymy mění svojí aktivitu, selhávají proteinové pumpy, v cytosolu se hromadí Ca2+, čímž se aktivují proteásy a fosfolipásy. Dochází ke vzniku nových antigenních determinant a autoimunitních reakcí.

DNA[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Dochází k poškození především hydroxylovým radikálem, který modifikuje a uvolňuje purinové a pyrimidinové báze. Vyjímá vodíkový radikál z deoxyribosy a je schopný se adovat k bázím a měnit je na hydroxy- a oxoderiváty. Následkem toho je pak chybné párování, přerušení řetězce. To se projevuje jako apoptóza, metageneze, karcinogeneze, stárnutí.

HO – uvolňuje Fe z enzymových center a tím mění aktivitu daných enzymů.

NO – váže se na železo v aktivních centrech enzymů a tím je inaktivuje (kataláza, cytochrom P450).

Nitrace strukturních proteinů (aktin, neurofilamenta) se projeví jako funkční následky v buněčném transportu a mobilitě.

Volné radikály při vzniku chorob[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Nekróza[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Nekróza.

Příčina: oxidační stres, ischemie, vyčerpání GSH. Následek: poškození membrán, bobtnání organel, lýza buňky.

Apoptóza[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Apoptóza a klinické důsledky poruch její regulace.

Může být zahájena vzestupem produkce ROS. Zdrojem ROS je respirační řetězec, proto hlavní spouštěcí faktory apoptózy jsou lokalizovány v mitochondriích.

Cytochrom c: Kromě přenášení e v respiračním řetězci se uvolňuje z mitochondriální membrány a plní antioxidační funkce (oxiduje superoxid unikající z komplexu I a III a získané e předává na komplex IV – zabrání tvorbě superoxidu). Nestačí-li mechanizmus zvládnout nápor superoxidu, cytochrom c proniká pomocí faktoru Bax přes zevní mitochondriální membránu do cytosolu, kde aktivuje apoptotickou proteolytickou kaskádu. Aktivují se proteázy – kaspázy, které podmíní fragmentaci buněčného jádra atd.

Ischemie nebo hypoxie[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Kyslík a ROS jsou hlavní patogenické faktory reperfuzního poškození tkáně. Vázne přenos elektronů v respiračním řetězci, což podmíní pokles ATP, hromadění AMP a hypoxantinu, selhává membránový transport iontů, stoupne koncentrace kalcia v cytosolu. Dochází k aktivaci genů pro syntézu stresových proteinů (heat shock proteins – HSP), které se jakožto chaperony navazují na nové (navozují správnou konformaci při rekonstrukci poškozených organel) i poškozené (pomáhají při odstraňování poškozených proteinů) proteiny.

Reperfuze[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Na začátku se v tkáni začne tvořit velké množství ROS, jejichž zdrojem jsou: Xantinooxidáza:

  • Endotelová – během ischemie se konvertuje XOR na XOD (schopná tvořit ROS).
  • Parenchynová a sliznični XOD – tvořena některými orgány (játra, střevo), také produkuje ROS.
  • Kyslík (z obnovené cirkulace) a nahromaděný hypoxantin jsou substráty xantinoxidázy k tvorbě superoxidu a peroxidu vodíku.

Neutrofily:

  • ROS indukují syntézu adhezivních molekul v endotelových buňkách (selektíny, ICAM – 1), což způsobí že neutrofily adherují k endotelu, prostupují do intersticia a produkují další ROS.
  • Alopurinol zabraňuje hromadění neutrofilů v ischemické tkáni.

Redukovaný respirační řetězec

Zvýšené uvolňování železa z feritinu

Zvýšená koncentrace cytosolového kalcia

  • Aktivuje fosfolipasu A2, tím dochází k aktivaci cyklooxigenasové a lipoxinasové cesty, při kterých též vznikají ROS.
  • Aktivuje syntézu NO a proteasy konvertující XOR na XOD.

Ischemie a reperfuze indukují tvorbu řady cytokinů (IL-1, IL-6, TGF-beta), které aktivují neutrofily k produkci superoxidu a kyseliny chlorné. To může podmínit rozvoj zánětu a oxidačního poškození. Intenzivní nedostatek kyslíku způsobí nekrózu, mírnější a protrahovanější nedostatek navodí apoptózu.

ROS v zánětu[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Zánět.

Rozhodující producent ROS v aktivovaných fagocytech – membránový enzymový systém NADPH-oxidázy. Ta je schopná zvýšit produkci volných radikálů stimulací Fc-receptoru, receptoru pro C3b- složku komplementu. Její aktivace vede k přesunu cytosolových komponent enzymu k plazmatické membráně a k vytvoření membránově vázaného makromolekulárního komplexu. Aktivace fagocytů a stimulace NADPH-oxidázy způsobí vzestup spotřeby kyslíku fagocytem – respirační vzplanutí (respiratory burst). Jejím působením se tedy kyslík redukuje na superoxid (donor e). Regeneruje se v pentózafosfátovém cyklu, proto respirační vzplanutí zahrnuje i vzestup oxidace glukózy. Následně ze superoxidu vzniká peroxid vodíku, hydroxylový radikál.

Působením myeloperoxidázy se tvoří chloridivý anion. Ten dává s H2O2 chlornanové ionty – reakci s aminy pak chloraminy. Oba typy mají mikrobicidní účinek.

RNS v zánětu[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Nejvíce se objevuje NO – vzniká působením NO-syntasy. Ta je při zánětu aktivovaná endotoxinem v makrofázích prostřednictvím aktivace transkripčního faktoru NF-κB

  • NO – stimuluje guanylátcyklasu v hladkých svalových buňkách a stimuluje vazodilataci (typické prokrvení tkáně v místě zánětu).
  • NO – reakcí se superoxidem vytváří peroxynitrit – k zabíjení intracelulárních patogenů.
  • NO – s thioly z tkáňových AMK vytváří S-nitrosothioly – antimikrobní účinky.

Diabetes[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Diabetes mellitus.

Citlivě reagují beta buňky pankreatu. Nalezena snížená hladina přirozených antioxidantů v krvi. Předpokládá se, že radikály působí škodlivě na cévní endotel v některých tkáních, a tak se stávají příčinou cévních komplikací diabetu. Dochází také k zánětům pankreatu s poškozením jeho beta buněk (asi původ v oxidačním stresu). Poškozují proteinové faktory, které drží v rovnováze plicní elastázu. Usnadní se štěpení elastinu v přepážkách mezi plicními alveoly čímž vzniká emfyzém plic.

Ateroskleróza[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Searchtool right.svg Podrobnější informace naleznete na stránce Ateroskleróza.

Volné radikály oxidují lipoproteiny LDL, které jsou dychtivě vychytávány makrofágy v cévní stěně. Základ ateromatozního patologického děje.

Další[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]

Revmatické onemocnění, poruchy IS, stavy demence při Alzheimerově chorobě, faktor stárnutí

Odkazy

Související články

Použitá literatura

  • LEDVINA, Miroslav, et al. Biochemie pro studující medicíny. 1. vydání. Praha : Karolinum, 2004. ISBN 80-246-0851-0.