Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)/103. Otázka


			103. Otázka
			Základní imunochemické metody. Imunoturbidimetrie, imunoanalytické metody se značenými protilátkami nebo antigeny. Monoklonální protilátky – příprava a využití.
			Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)
			⏪️ ⏩️

Histochemie

[ upravit vložený článek

]

Jedná se o histologickou metodu, při které prokazujeme ve vzorku tkáně přítomnost specifických látek nebo např. enzymatickou aktivitu. Využíváme při této metodě specifickou chemickou reakci. Tato metoda spojuje zobrazení morfologie buněk a tkání s popisem výskytu dané chemické látky v buňkách. Může se užívat i k průkazu buněčných inkluzí. V histochemii můžeme prokazovat přítomnost např. polysacharidů, lipidů, tak i funkčních enzymů.

Konvenční histochemie

Průkazy anorganických iontů a sloučenin

Diagnosticky významné je prokazování určitých látek v těle, ať už v případě soudního lékařství (zde např. kvůli otravám – As, Pb, Hg, Ag) nebo v patologii kvůli odchylkám od norem výskytu látek (Ca, Fe, Zn, Al).

Ca²⁺ se v těle vyskytuje v rozpustné, nerozpustné, ionizované i neionizované formě. Prokazuje se např. ionizovaný díky barvení HE modře v alkalické reakci (pH > 9).
Fe³⁺ se prokazuje pomocí Perlsovy reakce (viz níže).
Zn jako součást inzulinu či jako kofaktor mnohých enzymů se prokazuje pomocí zinconu s modrým výsledkem, dithizonem s červeným výsledkem

Perlsova reakce

Siderofágy (makrofágy) pohlcují staré nebo poškozené erytrocyty. Degradací hemu v nich pak vznikají železité ionty (najdeme je ještě ve ferritinu), které se ukládají do zásobní formy železa - hemosiderinu. Po přidání žluté krevní soli (hexokyanoželeznatan draselný) a HCl (pro vytvoření kyselého prostředí) vzniká reakcí s hemosiderinem modrá sraženina označovaná jako tzv. Berlínská modř (~ Prussian blue).

Perlsova reakce se tedy používá k průkazu hemosiderinu, který se ve velkém množství fyziologicky nachází pouze v siderofázích. Slouží také k odlišení lipofuscinu, hematoidinu a hematinu, které jsou Perls negativní.

Metodika barvení

Složení barvícího roztoku

ferrokyanid draselný (=hexokyanoželeznatan draselný, žlutá krevní sůl)
destilovaná voda
kyselina chlorovodíková (2%)

Řezy se umístí na 30 minut do barvícího roztoku při teplotě 60 °C. Poté jsou řezy vyjmuty z barvícího roztoku a dobarveny jádrovou červení nebo hematoxylinem.

PAS reakce

PAS (Periodic Acid Schiff) reakce je založena na oxidaci volných hydroxylových vazeb, např. 1,2-glykolová vazba mezi dvěma sousedními uhlíky v hexosách, pomocí kyseliny jodisté (HIO₄). Vznikají aldehydové skupiny, které reagují s Schiffovým reagens ( bazický fuchsin + pyrosiřičitan sodný Na₂S₂O₅) za vzniku nové komplexní sloučeniny, která má purpurovou barvu.

Struktury které lze touto metodou detekovat, označujeme jako PAS pozitivní (např. glykogen v játrech).

Metodika barvení

Složení Schiffova reagens:

bazický fuchsin (=pararosanilin)
destilovaná voda
pyrosiřičitan sodný
koncentrovaná kyselina chlorovodíková

Tkáňový řez se oxiduje v 1% kyselině jodisté po dobu 10 minut. Poté je vyjmut, opláchnut ve vodě a následuje barvení Schiffovým reagens po dobu 10 minut. Nakonec se řez opláchne v destilované vodě a dobarví hematoxylinem (10 minut).

Bestův karmín se používá jako metoda průkazu glykogenu v místě s příliš vysokou koncentrací, kde PAS metoda není přehledná.

Feulgenova reakce

Jedná se o reakci, která prokazuje přítomnost DNA. Spočívá v hydrolýze DNA pomocí kyseliny chlorovodíkové, přičemž se odštěpí purinové báze od sacharidů a odhalí se tak aldehydové skupiny na deoxyribóze. Poté, podobně jako u průkazu polysacharidů, reagují aldehydové skupiny s Schiffovým činidlem za vzniku nerozpustné purpurové sraženiny.

Metoda se používá například v patologii v nádorové diagnostice k určení polyploidie buněk.

Průkaz lipidů

Lipidy se prokazují na zmražených řezech díky tomu, že barvivo má větší afinitu k tukům ve tkáni, než k látce ve které je rozpuštěno. Barviva se tedy rozpouštějí v organických rozpouštědlech (isopropanolol, propylen glykol atd), která ale musí být dostatečně naředěna. K barvivům, která jsou užívána ke znázornění tuků, patří Sudan III a IV (červené) a Sudanová čerň (černé), dále olejová červeň nebo nilská modř (rozlišení kyselých a neutrálních lipidů). Tuky se z tkání nesmí během zpracování vyplavit. Jako fixační prostředek používáme Bakerovu tekutinu (voda, formol, chlorid vápenatý) – redukuje solubilitu nepolárních lipidů.

Průkaz fosfolipidů: Fosfolipidy barvíme luxolovou modří. Metoda je vhodná pro znázornění myelinové pochvy nervových vláken

Katalytická histochemie

Tato metoda je poměrně náročná, přičemž využívá základního principu, že enzym reaguje se substrátem, který je přeměn na konečný produkt histochemické reakce. Teprve tento produkt je poté přeměněn na barevnou sloučeninu (vizualizační reakce). Tento princip se využívá v mnoha aplikacích, tj. od markerů protilátek nebo hybridizačních sond (viz níže), přes detekce metabolických procesů v buňce, po patologie a soudního lékařství. Při všech těchto postupech se musí zachovat 4 základní pravidla pro uskutečnění katalytické histochemie:

Přesnost – při zachování morfologie sledovaných buněk či tkání nesmí produkt difundovat a musí zůstat v místech s předpokládaným výskytem enzymu.
Specifita – konečný produkt je výsledkem reakce pouze jednoho očekávaného enzymu. Toto se ověřuje na kontrolních řezech.
Reprodukovatelnost – pokus se může zopakovat bez významných odchylek.
Validita – při manipulaci s tkání nesmí být enzym ztracen, jeho distribuce a aktivita musí zůstat zachována.

Pro zachování funkce enzymu nelze tkáň obvykle fixovat.

Afinitní histochemie

Jeden z mladších oborů, který je stále více využíván jak ve výzkumu, tak v hlavně diagnostice. Umožňuje prokázat v cílové tkáni velmi nepatrná množství látek.

Imunohistochemie

Využívá se základního principu interakce antigen–protilátka, kdy se protilátky specificky vážou na cílový antigen, proti kterému byly „vypěstovány“. Monoklonální protilátky jsou produkovány hybridomy. Polyklonální protilátky vznikají po imunizaci v organismu člověka nebo zvířete. V imunohistochemii se využívají oba druhy protilátek. Přitom bývají nějakým způsoben označené, což umožňuje vizualizaci místa interakce a průkazu antigenů.

Využívá se buď přímého značení protilátky nebo se neznačená protilátka vizualizuje pomocí jiné značené protilátky:

Přímá reakce – v tomto případě nasedají primární protilátky, které jsou značené, na antigen. Označí tak místo interakce, avšak nevýhodou je nízká citlivost a nutnost použít zvýšené množství protilátek.
Nepřímá reakce, ABC reakce, PAP reakce atd. – zamezuje nevýhodám přímé reakce a zvyšuje senzitivitu reakce. Primární protilátka přisedá na svůj antigen a sekundární protilátky se vážou na primární protilátky. Antigen je tak označen mnohem vyšším počtem molekul markerů, čímž se zvyšuje citlivost reakce.

Mezi markery (značky), které se používají k vizualizaci reakce, patří:

fluorochromy – pro zviditelnění reakce ve fluorescenčním mikroskopu
avidin–biotinový komplex – komplex často užívaný k amplifikaci signálu (ABC metoda)
autoradiografie – protilátky nesou radioaktivní látky, které vysílají záření na fotografickou emulzi
enzymy – využívá se katalytické histochemie; protilátka nesoucí enzym přisedá na antigen a po dodání substrátu jej enzym přemění na barevný produkt např. PAP (peroxidása- antiperoxidása) reakce, AVB reakce (avidin biotin reakce)

Použití imunohistochemie umožňuje například zviditelnění filament cytoskeletu, hormonů, receptorů apod.

Lektinová histochemie

Lektiny jsou proteiny (nebo glykoproteiny), kterých se využívá například k určování krevních skupin, mitogenních stimulací lymfocytů či normálních buněk. Váží se vysoce specificky na sacharidové části makromolekul.

In situ hybridizace

Pokud je známa určitá sekvence nukleotidů v DNA či mRNA, je možné připravit označený kus sekvence (tzv. sondu/probu) komplementární k originální sekvenci nukleotidů. Na základě párování bazí pak přisedá označená proba na komplementární úsek DNA/mRNA a zviditelňuje jí. Užívá se pro i pro identifikaci chromosomů v interfázi, velmi často jako FISH (fluorescenční in situ hybridizace).

Podrobnější informace naleznete na stránkách Hybridizace in situ, Vyšetření chromozomů.

ELISA

[ upravit vložený článek

]

ELISA (angl. zkratka enzyme-linked immuno sorbent assay), známá také jako EIA (angl. zkratka enzyme immunoassay), je analytická metoda využívaná ke kvantitativnímu stanovení různých antigenů. Tato metoda má řadu variant. Všechny jsou založeny na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný. Stanovuje se pak spektrofotometricky (viz chromogenní substrát), nebo na základě fluorescence (fluorimetrické stanovení). Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul.

Postup

A: Standardní sendvičová ELISA na zjištění koncentrace antigenu:

navázání protilátky na dno zkumavky;
přidání vzorku a inkubace – dochází ke vzniku vazby antigen-protilátka;
odmytí nenavázaného antigenu;
přidání druhé protilátky, vázající stejný antigen, na které je kovalentně připojen enzym;
inkubace a odmytí nadbytečné protilátky s enzymem;
přidání substrátu a průběh enzymem katalyzované reakce;
zastavení reakce a měření.

Jako sendvičová se nazývá proto, že antigen je jako sendvič mezi dvěma protilátkami.

B: Obdobně lze reakci provést na detekci protilátek ve vzorku. To probíhá obdobně, jen je v 1. kroku navázán na zkumavku antigen a druhá protilátka je proti hledané protilátce. Tato metoda se označuje jako capture ELISA.

Schéma sendvičové ELISA metody.
Schéma capture ELISA metody.

Southernův blotting

[ upravit vložený článek

]

Využití a odvozené metody

Výkonným nástrojem pro rozdělování makromolekul s různou velikostí a nábojem je gelová elektroforéza. Molekuly DNA mají v podstatě stejný náboj na jednotku hmotnosti, takže se dělí na agarózových nebo polyakrylamidových gelech téměř výhradně na základě své velikosti nebo konformace. Agarózové a polyakrylamidové gely působí jako molekulární síta, která zpomalují průchod velkých molekul více než malých. Agarózové gely jsou vhodnější síta pro velké molekuly (nad několik set nukleotidů), zatímco polyakrylamidové gely jsou lepší pro rozdělování malých molekul DNA.

Analýza DNA pomocí Southernova blottingu

V roce 1975 publikoval E. M. Southern důležitý nový pracovní postup, který umožnil zjistit umístění genů a jiných sekvencí v restrikčních fragmentech separovaných gelovou elektroforézou. Základním rysem této metody je přenos molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. Takový přenos DNA je nazýván Southernův přenos. DNA je buď před, nebo během přenosu denaturována tím, že je gel umístěn do zásaditého roztoku. Po přenosu je DNA imobilizována na membráně vysušením nebo ozářením UV světlem a hybridizována s radioaktivní DNA-sondou obsahující studovanou sekvenci. Sonda bude hybridizovat pouze s molekulami DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci sondy.

Nehybridizované sondy jsou pak vymyty z povrchu membrány a takto upravená membrána je exponována na rentgenový film, aby mohla být detekována přítomnost radioaktivity. Po vyvolání filmu ukazují tmavé proužky pozici sekvencí DNA, které se sondou hybridizovaly. Schopnost přenosu molekul DNA separovaných gelovou elektroforézou na nylonové membrány za účelem hybridizačních studií a jiných druhů analýz se ukázala jako neobyčejně užitečná. Lze ji například využít při detekci genu cystické fibrózy atd.

Analýza RNA pomocí northernového blottingu

Jedná se o přenos molekul RNA po jejich separaci elektroforézou. Tento přenos se nazývá northernový přenos.

Jediný rozdíl od Southernova přenosu je, že se na membránu přenášejí molekuly RNA. Molekuly RNA jsou však velmi citlivé na degradaci RN-ázami, a proto musí být zabráněno kontaminaci materiálu tímto extrémně stabilním enzymem. Kromě toho, většina molekul RNA obsahuje sekundární strukturu a musí proto zůstat během elektroforézy denaturovaná, aby byla zajištěna separace na základě velikosti. Denaturace dosáhneme přidáním formaldehydu nebo některého denaturačního činidla do pufru používaného při elektroforéze.

Po přenosu na membránu RNA hybridizuje buď s DNA, nebo RNA-sondami, stejně jako je to u Southernova přenosu. Northernová hybridizace je nesmírně užitečná při studiích genové exprese. Může se použít k určení, kdy a kde se jednotlivé geny exprimují. Nicméně northernová hybridizace stanovuje pouze míru akumulace RNA-transkriptů a neposkytuje žádnou informaci o tom, proč k akumulaci došlo. Změny akumulace transkriptů mohou být způsobeny změnami rychlosti transkripce nebo naopak rychlosti degradace transkriptů.

Analýza proteinů westernovým přenosem

Někdy označován také jako imunoblot. Protože je mnoho funkčních proteinů složeno ze dvou nebo více podjednotek, jsou jednotlivé polypeptidy separovány v přítomnosti detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS), který denaturuje proteiny. Po proběhnutí elektroforézy se proteiny detekují barvením Coomassie modří nebo značením stříbrem. Rozdělené polypeptidy lze ale také přenést z gelu na nitrocelulózovou membránu a jednotlivé proteiny detekovat pomocí protilátek. Přenos se označuje jako westernový přenos a uskutečňuje se pomocí elektrického proudu

Po tomto přenosu se specifický protein identifikuje tak, že se membrána s imobilizovanými proteiny umístí do roztoku obsahujícím protilátku k tomuto proteinu. Následně se nenavázané protilátky z membrány odstraní vymytím. Přítomnost první (primární) protilátky se detekuje inkubací se sekundární protilátkou. Tato sekundární protilátka obecně reaguje s imunoglobuliny. Sekundární protilátka je spojena (konjugována) buď s radioaktivním izotopem nebo enzymem.