Metody sekvencování
Před určováním sekvence nukleotidů se nukleová kyselina nejdříve rozštěpí endonukleázou na kratší řetězce (oligonukleotidy). Částečným naštěpením oligonukleotidu např. fosfodiesterázou z hadího jedu lze získat směs štěpů lišících se o jeden nukleotid na 3’-konci (např. z CCUAGCA vznikne směs obsahující CCUAGCA, CCUAGC, CCUAG, CCUA, CCU, CC). Jednotlivé tyto štěpy byly rozpoznány podle velikosti pomocí elektroforézy. V každé elektroforetické frakci bylo nutno zjistit zastoupení bazí. Tento postup byl principem první metody stanovení sekvence nukleotidů v RNA. Jeho zdlouhavost je zřejmá, popsaným způsobem bylo nutné analyzovat jednotlivé krátké oligonukleotidy, a ty pak seřadit na základě analýzy aspoň dvou lyzátů výchozí nukleové kyseliny získaných dvěma různými endonukleázami s odlišnou specifitou.
Maxam a Gilbert nalezli rychlejší postup, když ke zjišťování primární struktury nukleových kyselin (sekvencování) použili chemické štěpení polynukleotidu u jednoho ze čtyř nukleotidů (pomocí dimetylsulfátu lze štěpit u guaninového, pomocí piperidinu u cytosinového nukleotidu apod.). Oligonukleotid se nejdříve označí na 5’-konci radioaktivním P32 a jeho roztok se rozdělí na čtyři stejné vzorky. Každý vzorek se naštěpí přednostně u jednoho ze čtyř nukleotidů. Zvolené podmínky umožní většinou jedno štěpení v molekule. Takže např. v oligonukleotidu 5’-P32-TACGTCGA se získají čtyři různé směsi štěpů. Radioaktivní 5’-koncové štěpy jsou uvedeny v tabulce:
Počet nukleotidů | ||
---|---|---|
1.vzorek | P32-TACGTCG | 7 |
(štěpení k A) | P32-T | 1 |
2.vzorek | P32-TACGTC | 6 |
(štěpení ke G) | P32-TAC | 3 |
3.vzorek | P32-TACGT | 5 |
(štěpení k C) | P32-TA | 2 |
4.vzorek | P32-TACG | 4 |
(štěpení k T) |
Tyto fragmenty se pak rozdělí polyakrylamidovou elektroforézou podle velikosti a frakce se detegují autoradiograficky nebo fluorescenčně. Sekvenci lze odečítat přímo z elektroforeogramu. Při hodnocení se postupuje od nejkratšího fragmentu a zaznamenává se typ lyzátu, ve kterém se štěp nachází (A, G, C nebo T). Moderní metody jsou upraveny pro analýzu DNA i RNA. Najednou lze vyhodnotit sekvenci i o délce několika set nukleotidů, elektroforeogramy jsou vyhodnocovány automaty a výsledky zpracovány počítačem.
Odkazy[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]
Související články[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]
- Struktura nukleových kyselin
- Základní složky nukleových kyselin
- Primární struktura nukleových kyselin
- Štěpení nukleové kyseliny hydrolýzou
- Sekundární struktura DNA
- Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace
- Sekundární struktura RNA
- Topologie DNA
- Interakce DNA s proteiny
- Bakteriální chromozom
- Eukaryotické chromosomy
- DNA mitochondrií
Zdroje[✎ upravit | ☲ editovat zdroj]
- ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : Uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Medprint, 1998. 92 s. s. 13–14. ISBN 80-902036-2-0.