Metody sekvencování

Review

Před určováním sekvence nukleotidů se nukleová kyselina nejdříve rozštěpí endonukleázou na kratší řetězce (oligonukleotidy). Částečným naštěpením oligonukleotidu např. fosfodiesterázou z hadího jedu lze získat směs štěpů lišících se o jeden nukleotid na 3’-konci (např. z CCUAGCA vznikne směs obsahující CCUAGCA, CCUAGC, CCUAG, CCUA, CCU, CC). Jednotlivé tyto štěpy byly rozpoznány podle velikosti pomocí elektroforézy. V každé elektroforetické frakci bylo nutno zjistit zastoupení bazí. Tento postup byl principem první metody stanovení sekvence nukleotidů v RNA. Jeho zdlouhavost je zřejmá, popsaným způsobem bylo nutné analyzovat jednotlivé krátké oligonukleotidy, a ty pak seřadit na základě analýzy aspoň dvou lyzátů výchozí nukleové kyseliny získaných dvěma různými endonukleázami s odlišnou specifitou.

Maxam a Gilbert nalezli rychlejší postup, když ke zjišťování primární struktury nukleových kyselin (sekvencování) použili chemické štěpení polynukleotidu u jednoho ze čtyř nukleotidů (pomocí dimetylsulfátu lze štěpit u guaninového, pomocí piperidinu u cytosinového nukleotidu apod.). Oligonukleotid se nejdříve označí na 5’-konci radioaktivním P³² a jeho roztok se rozdělí na čtyři stejné vzorky. Každý vzorek se naštěpí přednostně u jednoho ze čtyř nukleotidů. Zvolené podmínky umožní většinou jedno štěpení v molekule. Takže např. v oligonukleotidu 5’-P³²-TACGTCGA se získají čtyři různé směsi štěpů. Radioaktivní 5’-koncové štěpy jsou uvedeny v tabulce:

		Počet nukleotidů
1.vzorek	P32-TACGTCG	7
(štěpení k A)	P32-T	1
2.vzorek	P32-TACGTC	6
(štěpení ke G)	P32-TAC	3
3.vzorek	P32-TACGT	5
(štěpení k C)	P32-TA	2
4.vzorek	P32-TACG	4
(štěpení k T)

Tyto fragmenty se pak rozdělí polyakrylamidovou elektroforézou podle velikosti a frakce se detegují autoradiograficky nebo fluorescenčně. Sekvenci lze odečítat přímo z elektroforeogramu. Při hodnocení se postupuje od nejkratšího fragmentu a zaznamenává se typ lyzátu, ve kterém se štěp nachází (A, G, C nebo T). Moderní metody jsou upraveny pro analýzu DNA i RNA. Najednou lze vyhodnotit sekvenci i o délce několika set nukleotidů, elektroforeogramy jsou vyhodnocovány automaty a výsledky zpracovány počítačem.

Výsledek sekvenace úseku DNA automatickým sekvenátorem

Odkazy

Související články

• Struktura nukleových kyselin
• Základní složky nukleových kyselin
• Primární struktura nukleových kyselin
• Štěpení nukleové kyseliny hydrolýzou
• Sekundární struktura DNA
• Denaturace nukleových kyselin, molekulární hybridizace
• Sekundární struktura RNA
• Topologie DNA
• Interakce DNA s proteiny
• Bakteriální chromozom
• Eukaryotické chromosomy
• DNA mitochondrií

Další kapitoly z knihy ŠTÍPEK, S.: Stručná biochemie uchování a exprese genetické informace:

Struktura nukleových kyselin: Základní složky nukleových kyselin • Primární struktura nukleových kyselin • Řetězec nukleové kyseliny lze štěpit neenzymovou nebo enzymovou hydrolýzou • Metody sekvencování • Sekundární a vyšší struktura nukleových kyselin: Sekundární struktura DNA • Denaturace a reasociace řetězců nukleových kyselin, molekulární hybridizace • Sekundární struktura RNA • Topologie DNA; • Interakce DNA s proteiny, struktura chromosomu • Bakteriální chromosom • Eukaryotické chromosomy • DNA mitochondrií Biosyntéza nukleových kyselin: Replikace DNA • Transkripce Biosyntéza polypeptidového řetězce – translace: Transferové RNA (tRNA) • Aktivace aminokyselin, syntéza aminoacyl-tRNA • Funkce ribozómů v translaci • Translace u prokaryotů • Struktura ribozómů • Iniciace translace • Elongace peptidů • Terminace translace • Inhibitory bakteriální translace • Translace u eukaryotů • Struktura ribozómů • Iniciace eukaryotické translace • Elongace eukaryotické translace • Terminace eukaryotické translace • Inhibitory eukaryotické translace Genetický kód Biosyntéza nukleových kyselin a proteosyntéza v mitochondriích: Replikace mitochondriální DNA • Mitochondriální transkripce • Mitochondriální translace Řízení genové exprese a proteosyntézy: Řízení genové exprese a proteosyntézy u prokaryot • Regulace na úrovni transkripce • Regulace sigma-faktory • Jacobův-Monodův operonový model • Regulační význam cAMP u bakterií • Variace operonového řízení genů • Tryptofanový a arabinosový operon • Řízení terminace transkripce • Regulace bakteriální proteosyntézy na úrovni translace • Řízení genové exprese a proteosyntézy u eukaryot • Regulace na úrovni uspořádání genů • Regulace na úrovni transkripce • Regulace posttranskripčních úprav pre-mRNA • Regulace na úrovni translace • Řízení rychlosti degradace mRNA • Regulace funkce proteinu kotranslačními a posttranslačními úpravami Posttranslační úpravy a targeting proteinů: Signální sekvence polypeptidu, volné a vázané ribozómy • Posttranslační glykosylace proteinů • Targeting nezávislý na glykosylaci proteinů • Targeting mitochondriálních proteinů • Targeting jaderných proteinů • Rozhodovací mechanismus k destrukci nefunkčních proteinů • Receptorem zprostředkovaná endocytóza Biochemie virů: Reprodukce DNA virů • Reprodukce RNA virů • Interferony Biochemie genového inženýrství: Štěpení DNA na definovaném místě řetězce • Účinné dělení fragmentů DNA elektroforézou • Identifikace restrikčních fragmentů • Syntéza umělé DNA • Pomnožení a exprese izolovaného nebo umělého genu v hostitelské buňce

Zdroje

• ŠTÍPEK, Stanislav. Stručná biochemie : Uchování a exprese genetické informace. 1. vydání. Medprint, 1998. 92 s. s. 13–14. ISBN 80-902036-2-0.