Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)/72. Otázka

			72. Otázka
			Reaktivní formy kyslíku, vznik a význam, antioxidanty. Oxidační poškození biomolekul, peroxidace lipidů.
			Otázky z biochemie (1. LF UK, VL)
			⏪️   ⏩️

Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku

Reaktivní formy jsou součástí mnoha patologických, ale i fyziologických a biochemických pochodů. Nejčastěji jsou reaktivními formami tzv. volné radikály. Jako volný radikál označujeme jakoukoliv chemickou entitu (tj. atom, molekulu nebo iont), která má ve vnější sféře svého elektronového obalu alespoň jeden nespárovaný elektron. To způsobuje její relativně vysokou reaktivitu, ale zároveň je schopna samostatné existence.

Reaktivní formy mohou reagovat s mastnými kyselinami, lipidy, aminokyselinami, proteiny, mono a polynukleotidy (NK), s řadou nízkomolekulárních metabolitů, s koenzymy atd. Tyto reakce narušují struktury daných sloučenin, čímž způsobují patologie.

Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species)

Dlouhodobé vdechovaní čistého kyslíku působí na člověka toxicky (samotný kyslík jedovatý není). Toxicky na organismus působí jeho deriváty – reaktivní formy. Tyto deriváty vznikají i při normálním zásobení kyslíkem.

Pro některé děje v organismu jsou reaktivní formy nezbytné – přenos energie, faktory imunitní ochrany, signální molekuly buněčné regulace.

Volné kyslíkové radikály	Látky, které nejsou volnými radikály
Superoxid (•O2−)	Peroxid vodíku (H2O2)
Hydroxylový radikál (HO•)	Kyselina chlorná (HClO)
Peroxyl (ROO•)	Ozon (O3)
Hydroperoxyl (•HO2)	Singletový kyslík (1O2)

Vznik ROS

Superoxid •O₂⁻

Středně reaktivní kyslíkový radikál. Působí jako oxidační i redukční činidlo. Vzhledem k zápornému náboji má omezený průchod skrz buněčné membrány – prochází skrz aniontové kanály. Je schopný uvolnit železo z Fe-S clusteru v aktivním místě enzymu.

Vznik v organismu

Vznik v dýchacím řetězci

V těle může vzniknout v dýchacím řetězci na vnitřní membráně mitochondrií. Při vzniku elektrochemického protonového gradientu může dojít k úniku elektronů z komplexu I a III. Elektrony reagují s volným kyslíkem za vzniku superoxidu. Takto je přeměněno asi 1–2 % z celkové spotřeby kyslíku.

V dýchacím řetězci se postupně vytváří všechny základní ROS.

přijetím 1. e⁻: O₂ → •O₂⁻;

přijetím 2. e⁻: •O₂⁻ → H₂O₂;

přijetím 3. e⁻: H₂O₂ → H₂O + HO•;

přijetím 4. e⁻: HO• → H₂O.

Vznik NADPH-oxidázou

Buňky schopné fagocytózy tvoří superoxid jako zbraň proti mikroorganismům (respirační vzplanutí). Fagocyt (např. neutrofil) pentózovým cyklem spotřebovává glukózu za vzniku NADPH. Ten je dále převáděn na NADPH-oxidázu, která převádí kyslík na superoxid.

O₂ + NADPH → •O₂⁻ + NADP⁺

Dismutací superoxidu vzniká peroxid vodíku. Ten následně oxiduje chloridové anionty na kyselinu chlornou (HClO), která přispívá k ničení bakterií.

H₂O₂ + Cl⁻ → HClO + OH⁻

Vznik účinkem enzymů

Některé enzymy tvoří superoxid jako meziprodukt. Mezi takové řadíme například xanthinoxidázu, cyklooxygenázu a lipoxygenázu.

Vznik reakcí s hemoglobinem

Nejčastěji vzniká v erytrocytech. Dojde k tomu, že kyslík odebere jeden elektron Fe²⁺ v hemu. Tím dochází ke vzniku superoxidu a methemoglobinu. Erytrocyty tyto reakce regulují pomocí enzymů antioxidační ochrany (např. superoxiddismutáza).

Reakce

Dismutace

•O₂⁻ + •O₂⁻ + 2H⁺ → O₂ + H₂O₂

Tato reakce probíhá v organismu spontánně. Za přítomnosti enzymu superoxiddismutázy, dochází k přímému převodu superoxidu na peroxid.

Reakce s oxidem dusnatým

NO• + •O₂⁻ → OONO⁻ (peroxinitrit viz dále)

Peroxid vodíku H₂O₂

Patří mezi reaktivní formy, které nejsou radikály. Vzhledem k jeho malé velikosti může volně procházet skrz buněčné membrány – působí na jiném místě, než kde vznikl. Sám o sobě není příliš reaktivní. Jeho reaktivita se zvýší při interakci s přechodným kovem (železo a měď).

Vznik v organismu

Peroxid vodíku vzniká již zmíněnou dismutací superoxidu, případně působením některých enzymů – xanthinoxidáza, monoaminooxidáza. Bezpečné odstranění peroxidu vodíku z organismu zabezpečuje glutathionperoxidáza, peroxiredoxin nebo kataláza.

Reakce

Fentonova reakce

H₂O₂ + Fe²⁺ → OH⁻ + OH• + Fe³⁺

K této reakci dochází při interakci peroxidu s železnatým kationtem. Vzniká hydroxylový radikál, který je nejnebezpečnějším oxidačním činidlem v organismu. Fentonova reakce patří mezi základní mechanismus oxidačního poškození tkání.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Fentonova reakce.

Hydroxylový radikál OH•

Extrémně reaktivní molekula. Okamžitě po svém vzniku reaguje s nejbližší možnou strukturou. Poškozuje biomolekuly ve svém okolí (buněčné membrány, proteiny, DNA). Nejčastěji je příčinou tvorby lipoperoxidů.

Vznik v organismu

V těle může vznikat již popsanou Fentonovou reakcí (peroxid vodíku s přechodným kovem).

Dále vzniká působením ionizačního záření (např. gama záření, rentgenové záření). Ionizační záření rozkládá nejčastěji vodu (té je v organismu velké množství).

H₂O → H⁺ + OH•

Pokud ionizační záření působí na kyslík, dochází ke vzniku tzv. singletového kyslíku ¹O₂, který stejně jako hydroxylový radikál, reaguje s MK za vzniku lipoperoxidů.

Reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species)

Volné dusíkaté radikály	Látky, které nejsou volnými radikály
Oxid dusnatý (NO•)	Nitrosyl (NO+)
Oxid dusičitý (NO2•)	Nitroxid (NO)
	Peroxynitrit (ONOO−)
	Alkylperoxynitrit (ROONO)

Oxid dusnatý NO

Plynný radikál s krátkým biologickým poločasem. Při vdechnutí působí na organismus toxicky (ve smogu). Uvnitř těla je vytvářen fyziologicky jako mediátor (např. vazodilatace). Vazbou na guanylátcyklázu stimuluje tvorbu cGMP vedoucí k relaxaci hladkého svalstva. Má velkou afinitu k hemovému železu. Je vychytáván erytrocyty, ve kterých reaguje s hemoglobinem za vzniku methemoglobinu a nitrátu (fyziologická inaktivace NO).

Vznik v organismu

NO syntázová reakce

L-arginin + O₂ + NADPH → L-citrullin + NADP⁺ + NO•

Rozlišujeme tři různé syntázy, které se odlišují dle místa působení. NOS I (neuronální, konstitutivní) – paměť a učení, NOS II (fagocyty, inducibilní) – stimulována cytokiny a mikroby, NOS III (endoteliální, konstitutivní) – vazodilatační účinek.

Reakce

Reakce se superoxidem

Při reakci NO• se •O₂⁻, dochází ke vzniku peroxynitritu, který je nejvýznamnějším toxickým produktem oxidu dusnatého.

NO• + •O₂⁻ → OONO⁻ (peroxynitrit)

Peroxinitrit je nejvýkonnější producent volných radikálů v buňkách.

OONO⁻ + H⁺ → HOONO (kyselina peroxydusitá) → OH• + •NO₂

Patogeneze

Mezi hlavní cílové struktury, na které reaktivní formy působí:

Nenasycené MK v lipidech (buněčné membrány)

Poškození mastných kyselin může způsobit ztrátu dvojných vazeb a podmíní tvorbu reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy). To způsobí změnu fluidity a propustnosti membrán. Dojde ke vzniku chemoreaktivních látek pro mikrofágy.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Peroxidace lipidů.

Proteiny

Poškození proteinů může způsobit jejich agregaci, síťování, fragmentaci, štěpení, reakci s hemovým železem, modifikace thiolových skupin a benzenovách jader AMK. To způsobí změny v transportu iontů (vstup Ca²⁺ do cytosolu) a změny v aktivitě enzymů.

DNA

Poškození DNA může způsobit štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce. To se pak může projevit jako mutace, translační chyby a inhibice proteosyntézy.

Celkově můžeme říci, že reaktivní formy jsou přímou příčinou chorobného stavu u kancerogeneze v důsledku ionizačního záření, retinopatie nedonošených a hemochromatózy. Významně se podílí v patogenezi chronického zánětu, ARDS, aterosklerózy, mozkového traumatu, diabetu, ischemie a stárnutí.

Peroxidace lipidů

Peroxidace lipidů (lipoperoxidace) je oxidativní poškození vyšších mastných kyselin. K lipoperoxidaci může dojít působením volných radikálů (látky s dostatečnou afinitou k elektronům). Tyto látky jsou schopné vytrhnout vodíkový atom (proton a elektron) z methylenové skupiny MK. Vytržení protonu může zahájit řetězovou reakci, kdy poškozená molekula působí jako volný radikál na molekulu sousední.

Nejčastěji se lipoperoxidace účastní hydroxylový radikál •OH, alkoxylový radikál RO• a peroxylový radikál ROO•.

Peroxidaci podléhají především nenasycené vyšší mastné kyseliny, které jsou součástí fosfolipidů biologických membrán a plazmatických lipoproteinů. Nejlépe jí podléhají mastné kyseliny, které obsahují dvě a více dvojných vazeb oddělených methylenovou skupinou (kyselina linolová, linolenová, arachidonová). Nasycené MK podléhají peroxidaci jen výjimečně.

Průběh peroxidace lipidů

Peroxidace mastných kyselin

Iniciace

Dochází k odštěpení atomu vodíku z MK působením volného radikálu. Vzniká tak volný radikál mastné kyseliny (L•) a voda.

L–H + HO• → H₂O + L•

Odejmutí vodíku způsobí přesmyk. V původní mastné kyselině byly dvě dvojné vazby odděleny dvěma jednoduchými. Po přesmyku jsou dvě dvojné vazby odděleny pouze jednou jednoduchou a vzniká konjugovaný dien (velmi reaktivní).

Konjugovaný dien reaguje s přítomným kyslíkem za vzniku peroxylového radikálu (L–O–O•).

L• + O₂ → L–O–O•

Propagace

Peroxylový radikál je velmi reaktivní sloučenina. Ze sousední mastné kyseliny odebírá atom vodíku a přeměňuje se na lipoperoxid (LOOH). Mastná kyselina se stává radikálem, který může napadat další molekuly – řetězová reakce.

L–O–O• + L–H → L• + L–O–O–H

Lipoperoxidy označujeme jako primární produkty peroxidace lipidů.

Další osud primárních produktů vede ke vzniku produktů sekundárních. Ty mohou vznikat cyklizací bez změny počtu atomů uhlíku, štěpením za vzniku aldehydů, uhlovodíku či oxokyselin s nižším počtem uhlíků nebo polymerací. Takto vzniklé sloučeniny (např. malondialdehyd – toxický, vazba na proteiny – změna jejich funkce) jsme schopni detekovat laboratorně.

Terminace

K ukončení řetězové reakce může dojít:

• při vyčerpání substrátu,
• vzájemnou reakcí dvou radikálů,

L• + L• → L–L

L• + L–O–O• → L–O–O–L

L–O–O• + L–O–O• → L–O–O–L + O₂

• působením antioxidantů (tokoferol).

L–O–O• + T–OH → L–O–O–H + T–O• (není dostatečně reaktivní)

Důsledky lipoperoxidace

Působením volných radikálů dochází ke změně struktur i biologických funkcí napadených sloučenin. Při napadení lipoproteinových částic (především LDL) dochází k rozvoji předčasné aterosklerózy.

Reaktivní formy nenarušují pouze struktury lipidů, ale také proteinů a DNA, což vede k jejich modifikaci, mutacím, karcinogenezím, apoptózám, urychlení procesu stárnutí a autoimunitním reakcím.

Peroxidace lipidů za účasti přechodných kovů

Průběh lipoperoxidace může být urychlen ionty přechodných kovů (železo, měď).

Působení železa

Železo je prvek potřebný pro erytropoézu a funkci některých enzymů (dýchací řetězec, hemoproteinové enzymy, cytochromy). Získává se z potravy. Vstřebávaní závisí na jeho aktuální potřebě. Většina železa v těle cirkuluje – minimální ztráty (nejčastěji při krvácení).

Volné železo se v těle prakticky nevyskytuje. Obvykle bývá vázáno v enzymech nebo na proteinech (feritin, transferin, laktoferin). Pokud se objeví v těle volně, může katalyzovat Fentonovu reakci.

Riziko uvolnění železa z vazby na enzymy a proteiny je například při intravaskulární hemolýze (za předpokladu že haptoglobin a hemopexin nestačí vychytávat uvolněný Hb). Dále při poškození buněk obsahujících enzymy využívající železo (hepatocyty, syntéza hemu). Při traumatu svalů a uvolnění myoglobinu.

Fentonova reakce

Fe²⁺ reaguje s peroxidem vodíku za vzniku Fe³⁺, hydroxidového aniontu a hydroxylového radikálu (vysoce reaktivní).

H₂O₂ + Fe²⁺ → OH⁻ + •OH + Fe³⁺

 Podrobnější informace naleznete na stránce Fentonova reakce.

Další reakce volného železa v těle

Navázáním kyslíku na hemoglobin vzniká oxyhemoglobin. Při této interakci může dojít k oxidaci hemového železa Fe²⁺ na Fe³⁺, kdy se kyslík přeměňuje na superoxid. Ten dále působí na buněčné struktury – oxidační stres.

Hladina reaktivních forem musí být v erytrocytech (i v celém organismu) regulována antioxidačními enzymy.

Působení mědi

V krvi je měď vázaná a přenášená ceruloplazminem. Ceruloplazmin s navázanou mědí zodpovídá za přeměnu Fe²⁺ na Fe³⁺, aby nedocházelo k přítomnosti volného hemového železa a následně k Fentonově reakci. Měď je nezbytná pro funkci antioxidačních enzymů (superoxiddismutázy), ale i jiných enzymů, jako jsou cytochromoxidázy a tyrozinázy.

Při defektu ceruloplazminu (Wilsonova choroba) dochází k poruchám transportu mědi a tím ke zvýšenému oxidačnímu stresu v těle.