Portál:Otázky z biochemie (1. LF UK, VL, ÚLB)/Reaktivní formy kyslíku, vznik a význam, antioxidantů

Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku

Reaktivní formy jsou součástí mnoha patologických, ale i fyziologických a biochemických pochodů. Nejčastěji jsou reaktivními formami tzv. volné radikály. Jako volný radikál označujeme jakoukoliv chemickou entitu (tj. atom, molekulu nebo iont), která má ve vnější sféře svého elektronového obalu alespoň jeden nespárovaný elektron. To způsobuje její relativně vysokou reaktivitu, ale zároveň je schopna samostatné existence.

Reaktivní formy mohou reagovat s mastnými kyselinami, lipidy, aminokyselinami, proteiny, mono a polynukleotidy (NK), s řadou nízkomolekulárních metabolitů, s koenzymy atd. Tyto reakce narušují struktury daných sloučenin, čímž způsobují patologie.

Reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species)

Dlouhodobé vdechovaní čistého kyslíku působí na člověka toxicky (samotný kyslík jedovatý není). Toxicky na organismus působí jeho deriváty – reaktivní formy. Tyto deriváty vznikají i při normálním zásobení kyslíkem.

Pro některé děje v organismu jsou reaktivní formy nezbytné – přenos energie, faktory imunitní ochrany, signální molekuly buněčné regulace.

Volné kyslíkové radikály	Látky, které nejsou volnými radikály
Superoxid (•O2−)	Peroxid vodíku (H2O2)
Hydroxylový radikál (HO•)	Kyselina chlorná (HClO)
Peroxyl (ROO•)	Ozon (O3)
Hydroperoxyl (•HO2)	Singletový kyslík (1O2)

Vznik ROS

Superoxid •O₂⁻

Středně reaktivní kyslíkový radikál. Působí jako oxidační i redukční činidlo. Vzhledem k zápornému náboji má omezený průchod skrz buněčné membrány – prochází skrz aniontové kanály. Je schopný uvolnit železo z Fe-S clusteru v aktivním místě enzymu.

Vznik v organismu

Vznik v dýchacím řetězci

V těle může vzniknout v dýchacím řetězci na vnitřní membráně mitochondrií. Při vzniku elektrochemického protonového gradientu může dojít k úniku elektronů z komplexu I a III. Elektrony reagují s volným kyslíkem za vzniku superoxidu. Takto je přeměněno asi 1–2 % z celkové spotřeby kyslíku.

V dýchacím řetězci se postupně vytváří všechny základní ROS.

přijetím 1. e⁻: O₂ → •O₂⁻;

přijetím 2. e⁻: •O₂⁻ → H₂O₂;

přijetím 3. e⁻: H₂O₂ → H₂O + HO•;

přijetím 4. e⁻: HO• → H₂O.

Vznik NADPH-oxidázou

Buňky schopné fagocytózy tvoří superoxid jako zbraň proti mikroorganismům (respirační vzplanutí). Fagocyt (např. neutrofil) pentózovým cyklem spotřebovává glukózu za vzniku NADPH. Ten je dále převáděn na NADPH-oxidázu, která převádí kyslík na superoxid.

O₂ + NADPH → •O₂⁻ + NADP⁺

Dismutací superoxidu vzniká peroxid vodíku. Ten následně oxiduje chloridové anionty na kyselinu chlornou (HClO), která přispívá k ničení bakterií.

H₂O₂ + Cl⁻ → HClO + OH⁻

Vznik účinkem enzymů

Některé enzymy tvoří superoxid jako meziprodukt. Mezi takové řadíme například xanthinoxidázu, cyklooxygenázu a lipoxygenázu.

Vznik reakcí s hemoglobinem

Nejčastěji vzniká v erytrocytech. Dojde k tomu, že kyslík odebere jeden elektron Fe²⁺ v hemu. Tím dochází ke vzniku superoxidu a methemoglobinu. Erytrocyty tyto reakce regulují pomocí enzymů antioxidační ochrany (např. superoxiddismutáza).

Reakce

Dismutace

•O₂⁻ + •O₂⁻ + 2H⁺ → O₂ + H₂O₂

Tato reakce probíhá v organismu spontánně. Za přítomnosti enzymu superoxiddismutázy, dochází k přímému převodu superoxidu na peroxid.

Reakce s oxidem dusnatým

NO• + •O₂⁻ → OONO⁻ (peroxinitrit viz dále)

Peroxid vodíku H₂O₂

Patří mezi reaktivní formy, které nejsou radikály. Vzhledem k jeho malé velikosti může volně procházet skrz buněčné membrány – působí na jiném místě, než kde vznikl. Sám o sobě není příliš reaktivní. Jeho reaktivita se zvýší při interakci s přechodným kovem (železo a měď).

Vznik v organismu

Peroxid vodíku vzniká již zmíněnou dismutací superoxidu, případně působením některých enzymů – xanthinoxidáza, monoaminooxidáza. Bezpečné odstranění peroxidu vodíku z organismu zabezpečuje glutathionperoxidáza, peroxiredoxin nebo kataláza.

Reakce

Fentonova reakce

H₂O₂ + Fe²⁺ → OH⁻ + OH• + Fe³⁺

K této reakci dochází při interakci peroxidu s železnatým kationtem. Vzniká hydroxylový radikál, který je nejnebezpečnějším oxidačním činidlem v organismu. Fentonova reakce patří mezi základní mechanismus oxidačního poškození tkání.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Fentonova reakce.

Hydroxylový radikál OH•

Extrémně reaktivní molekula. Okamžitě po svém vzniku reaguje s nejbližší možnou strukturou. Poškozuje biomolekuly ve svém okolí (buněčné membrány, proteiny, DNA). Nejčastěji je příčinou tvorby lipoperoxidů.

Vznik v organismu

V těle může vznikat již popsanou Fentonovou reakcí (peroxid vodíku s přechodným kovem).

Dále vzniká působením ionizačního záření (např. gama záření, rentgenové záření). Ionizační záření rozkládá nejčastěji vodu (té je v organismu velké množství).

H₂O → H⁺ + OH•

Pokud ionizační záření působí na kyslík, dochází ke vzniku tzv. singletového kyslíku ¹O₂, který stejně jako hydroxylový radikál, reaguje s MK za vzniku lipoperoxidů.

Reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species)

Volné dusíkaté radikály	Látky, které nejsou volnými radikály
Oxid dusnatý (NO•)	Nitrosyl (NO+)
Oxid dusičitý (NO2•)	Nitroxid (NO)
	Peroxynitrit (ONOO−)
	Alkylperoxynitrit (ROONO)

Oxid dusnatý NO

Plynný radikál s krátkým biologickým poločasem. Při vdechnutí působí na organismus toxicky (ve smogu). Uvnitř těla je vytvářen fyziologicky jako mediátor (např. vazodilatace). Vazbou na guanylátcyklázu stimuluje tvorbu cGMP vedoucí k relaxaci hladkého svalstva. Má velkou afinitu k hemovému železu. Je vychytáván erytrocyty, ve kterých reaguje s hemoglobinem za vzniku methemoglobinu a nitrátu (fyziologická inaktivace NO).

Vznik v organismu

NO syntázová reakce

L-arginin + O₂ + NADPH → L-citrullin + NADP⁺ + NO•

Rozlišujeme tři různé syntázy, které se odlišují dle místa působení. NOS I (neuronální, konstitutivní) – paměť a učení, NOS II (fagocyty, inducibilní) – stimulována cytokiny a mikroby, NOS III (endoteliální, konstitutivní) – vazodilatační účinek.

Reakce

Reakce se superoxidem

Při reakci NO• se •O₂⁻, dochází ke vzniku peroxynitritu, který je nejvýznamnějším toxickým produktem oxidu dusnatého.

NO• + •O₂⁻ → OONO⁻ (peroxynitrit)

Peroxinitrit je nejvýkonnější producent volných radikálů v buňkách.

OONO⁻ + H⁺ → HOONO (kyselina peroxydusitá) → OH• + •NO₂

Patogeneze

Mezi hlavní cílové struktury, na které reaktivní formy působí:

Nenasycené MK v lipidech (buněčné membrány)

Poškození mastných kyselin může způsobit ztrátu dvojných vazeb a podmíní tvorbu reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy). To způsobí změnu fluidity a propustnosti membrán. Dojde ke vzniku chemoreaktivních látek pro mikrofágy.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Peroxidace lipidů.

Proteiny

Poškození proteinů může způsobit jejich agregaci, síťování, fragmentaci, štěpení, reakci s hemovým železem, modifikace thiolových skupin a benzenovách jader AMK. To způsobí změny v transportu iontů (vstup Ca²⁺ do cytosolu) a změny v aktivitě enzymů.

DNA

Poškození DNA může způsobit štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce. To se pak může projevit jako mutace, translační chyby a inhibice proteosyntézy.

Celkově můžeme říci, že reaktivní formy jsou přímou příčinou chorobného stavu u kancerogeneze v důsledku ionizačního záření, retinopatie nedonošených a hemochromatózy. Významně se podílí v patogenezi chronického zánětu, ARDS, aterosklerózy, mozkového traumatu, diabetu, ischemie a stárnutí.

Antioxidační ochrana lidského těla

Při metabolických pochodech vznikají reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species – ROS) a reaktivní formy dusíku (reactive nitrogen species – RNS). Všechny reaktivní formy dusíku významné z biologického hlediska obsahují i atom kyslíku, někdy se proto označují také jako reaktivní formy kyslíku a dusíku (reactive oxygen and nitrogen species, RONS).

Reaktivní formy kyslíku a dusíku

Zahrnují dvě skupiny látek:

Volné radikály

Obsahují nepárový elektron, díky čemuž jsou velmi reaktivní. Typickými zástupci jsou např. hydroxylový radikál ·OH, superoxid O₂^·− nebo oxid dusnatý NO·.

Neradikálové reaktivní formy

Sloučeniny kyslíku (popř. kyslíku a dusíku), které sice samy nemají povahu volných radikálů, ty z nich však mohou snadno vznikat dalšími reakcemi. Patří mezi ně např. peroxid vodíku H₂O₂ nebo peroxinitrit ONOO⁻.

Volné radikály vznikají třemi různými způsoby: homolytickým štěpením kovalentní vazby, redukcí (přidáním jednoho elektronu) nebo oxidací (ztrátou jednoho elektronu). Reaguje-li radikál s jinou normální molekulou, změní ji také na radikál (propagace radikálové reakce). K dokončení radikálové reakce dojde až reakcí dvou radikálů. Volné radikály poškozují mastné kyseliny, lipidy a proteiny, současně se ale i podílejí na imunitní ochraně organismu.

 Podrobnější informace naleznete na stránce Základní reaktivní formy kyslíku a dusíku.

Prospěšnost ROS ve zdravém organismu

Hydroxylový radikál vznikající činností enzymu monooxygenázy je v játrech důležitý pro hydroxylaci xenobiotik včetně léků, a v nadledvinách pro hydroxylaci steroidů (vznik žlučových kyselin). Neutrofily a makrofágy používají reaktivní formy kyslíku (superoxid a peroxid vodíku) k odstraňování zbytků mrtvých buněk a k fagocytóze bakterií. Jako významný lokální hormon a neurotransmiter se oxid dusnatý podílí na relaxaci hladké svaloviny cév, GIT a corpus cavernosum penis. Má antiagregační a antiadhezivní účinek na trombocyty a leukocyty a v CNS ovlivňuje učení a paměť.

Antioxidační ochrana

Nadměrnému působení volných radikálů se organismus brání třemi způsoby. Jednak se brání tvorbě velkého množství regulací enzymů, které je tvoří. Druhou možností je zachycení a odstranění již vytvořených radikálů, toho se účastní enzymové a endogenní antioxidanty. Selžou-li dva předchozí mechanismy, uplatní se reparační mechanismy poškozených biomolekul.

Antioxidační enzymy

Superoxiddismutáza

Je součástí každé buňky. Katalyzuje dismutaci superoxidu na dioxygen a peroxid vodíku:

     O2•- + O2•- + 2H+ → O2 + H2O2

Je nepostradatelná pro život na naší planetě. Ve třech formách se vyskytuje extracelulárně a v mitochondriích eukaryot a prokaryot.

Glutathionperoxidáza

Pomocí tripeptidu glutathionu redukuje peroxid vodíku na vodu:

     2 GSH + H2O2 → GS-SG + 2 H2O

Vyskytuje se v několika formách, v aktivním místě obsahuje selenocystein.

Antioxidační působení enzymů na ROS

Kataláza

Tetramer, každý obsahuje jednu prostetickou protoporfyrinovou skupinu s Fe ³⁺. Katalyzuje dismutaci peroxidu vodíku na kyslík a vodu. Vyskytuje se v peroxisomech a erytrocytech.

Vysokomolekulární endogenní antioxidanty

Vysokomolekulární endogenní antioxidanty jsou proteiny schopné vázat přechodné prvky (železo a měď) a měnit jejich oxidoredukční vlastnosti tak, aby přestaly katalyzovat radikálové reakce.

• transferin / laktoferin (váže Fe³⁺);
• feritin (skladování Fe³⁺);
• haptoglobin / hemopexin (váže cirkulující hemoglobin / hem);
• ceruloplazmin;
• albumin.

Nízkomolekulární endogenní antioxidanty

• Askorbát (vitamin C);
• Alfa tokoferol (vitamin E);
• Koenzym Q;
• Karotenoidy, Beta-karoten a vitamin A;
• Thioly a disulfidy;
• Kyselina močová, bilirubin.

Patobiochemie antioxidační ochrany

Je-li vznik reaktivních forem kyslíku a dusíku větší než jejich odstraňování, dojde ke vzniku nerovnováhy nazývané oxidační stres.